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最近，小編收到甲方工廠QC實(shí)驗(yàn)室反饋的問題，原料藥某雜質(zhì)（中性化合物）檢測時，方法無法重現(xiàn)（該雜質(zhì)峰未在規(guī)定的等度時間段出峰），而前期該方法已經(jīng)完成方法轉(zhuǎn)移（前期工作由其他同事完成）。

檢測該雜質(zhì)色譜條件如下：流動相（A）磷酸鹽（pH7.0），流動相（B）甲醇；洗脫梯度：0-10min，70%A；10.1-18min，70%-20%A；18.1-25min，70%A；色譜柱：Ultimate Xtimate C18；檢測波長：254nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20µl。

甲方QC實(shí)驗(yàn)室通過其他同事進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，仍然無法重現(xiàn)方法，可能是雜質(zhì)對照品問題或者色譜柱問題。

研發(fā)實(shí)驗(yàn)室采用性能良好的Ultimate Xtimate C18色譜柱進(jìn)行方法重現(xiàn)，進(jìn)樣雜質(zhì)對照品溶液，結(jié)果與甲方實(shí)驗(yàn)室一致，排除對照品問題，確認(rèn)是色譜柱問題。

圖1 性能良好的Ultimate Xtimate C18色譜圖

研發(fā)實(shí)驗(yàn)室方法驗(yàn)證時的色譜圖（舊的Ultimate Xtimate C18）如下：

通過上述兩張色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，該雜質(zhì)在相同品牌、規(guī)格、型號但批次不一致的色譜柱上的保留時間差異很大，而且該雜質(zhì)在新色譜柱上的拖尾因子在0.8-1.5之外。查閱舊的Ultimate Xtimate C18（方法驗(yàn)證及方法轉(zhuǎn)移用的同一根）的使用歷史，較長時間使用過離子對試劑，該雜質(zhì)驗(yàn)證的時候拿了該色譜柱進(jìn)行方法驗(yàn)證及方法轉(zhuǎn)移，應(yīng)該是離子對試劑導(dǎo)致色譜柱改性，以致方法無法重現(xiàn)。

在上述色譜條件下考察色譜柱的耐用性，大多數(shù)色譜柱無法重現(xiàn)該方法，在安捷倫ZORBAX SB-AQ C18與Waters Cortecs T3色譜柱上，該雜質(zhì)峰在等度時間出峰，但峰形差，考慮到工廠QC實(shí)驗(yàn)室對該方法的使用，重新進(jìn)行方法建立。

備注：篩選色譜柱時，直接通過等度方法查看雜質(zhì)峰的保留時間。

查閱文獻(xiàn)，色譜條件如下：流動相（A）磷酸鹽（pH8.0），流動相（B）乙腈；洗脫梯度：0-10min，52%A；10.1-18min，52%-20%A；18.1-25min，52%A；色譜柱：Waters Xbridge C18；檢測波長：254nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20µl。典型色譜圖如下：

圖2 雜質(zhì)對照品溶液典型圖譜

圖3 加標(biāo)供試品溶液典型圖譜

圖4 加標(biāo)供試品溶液典型圖譜（同品牌、型號、規(guī)格但批次不一致色譜柱）

后續(xù)對新方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，然后在進(jìn)行方法轉(zhuǎn)移。

建議在方法開發(fā)時盡可能用比較新的且性能良好的色譜柱，滿足要求就直接用，后續(xù)及時采購新的色譜柱進(jìn)行補(bǔ)充；方法開發(fā)的時候，用同品牌規(guī)格型號不同批次和不同品牌的色譜柱進(jìn)行代替，考察色譜柱的耐用性；用過可能改性試劑（如離子對試劑、高鹽緩沖液）的色譜柱做好標(biāo)識，色譜柱臺賬要及時填寫。