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本品為飲用水經蒸餾法、離子交換法、反滲透法或其他適宜的方法制得的制藥用水備所得，不含任何添加劑。

【性狀】本品為無色的澄清液體；無臭。

【檢查】酸堿度  取本品10ml，加甲基紅指示液2滴，不得顯紅色；另取10ml，加溴麝香草酚藍指示液5滴，不得顯藍色。

硝酸鹽  取本品5ml置試管中，于冰浴中冷卻，加10%氯化鉀溶液0.4ml與0.1%二苯胺硫酸溶液0.1ml，搖勻，緩緩滴加硫酸5ml，搖勻，將試管于50℃水浴中放置15分鐘，溶液產生的藍色與標準硝酸鹽溶液［取硝酸鉀0.163g，加水溶解并稀釋至100ml，搖勻，精密量取1ml，加水稀釋成100ml，再精密量取10ml，加水稀釋成100ml，搖勻，即得（每1ml相當于1μgNO₃）］0.3ml，加無硝酸鹽的水4.7ml，用同一方法處理后的顏色比較，不得更深（0.000 006%）。

亞硝酸鹽  取本品10ml，置納氏管中，加對氨基苯磺酰胺的稀鹽酸溶液（1→100）1ml與鹽酸萘乙二胺溶液（0.1→100）1ml，產生的粉紅色，與標準亞硝酸鹽溶液［取亞硝酸鈉0.750g（按干燥品計算），加水溶解，稀釋至100ml，搖勻，精密量取1ml，加水稀釋成100ml，搖勻，再精密量取1ml，加水稀釋成50ml，搖勻，即得（每1ml相當于1μgNO₂）］0.2ml，加無亞硝酸鹽的水9.8ml，用同一方法處理后的顏色比較，不得更深（0.000 002%）。

氨  取本品50ml，加堿性碘化汞鉀試液2ml，放置15分鐘；如顯色，與氯化銨溶液（取氯化銨31.5mg，加無氨水適量使溶解并稀釋成1000ml）1.5ml，加無氨水48ml與堿性碘化汞鉀試液2ml制成的對照液比較，不得更深（0.000 03%）。

電導率  按制藥用水電導率測定法（通則0681）中純化水測定法測定，應符合規(guī)定（通則0681）。

    如按制藥用水電導率測定法（通則0681）中注射用水測定法測定，電導率按判定法第一步判定符合規(guī)定，即為電導率符合規(guī)定，可不再進行酸堿度、重金屬、硝酸鹽、亞硝酸鹽和氨檢查。

    如按制藥用水電導率測定法（通則0681）中注射用水測定法測定，電導率按判定法第一步判定不符合規(guī)定，但按判定法第二步或第三步判定符合規(guī)定，即為電導率符合規(guī)定，可不再進行酸堿度和重金屬檢查。

總有機碳  不得過0.50mg/L（通則0682）。

易氧化物  取本品100ml，加稀硫酸10ml，煮沸后，加高錳酸鉀滴定液（0.02mol/L）0.10ml，再煮沸10分鐘，粉紅色不得完全消失。

　　以上總有機碳和易氧化物兩項可選做一項。

不揮發(fā)物  取本品100ml，置105℃恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，并在105℃干燥至恒重，遺留殘渣不得過1mg。

重金屬  取本品100ml，加水19ml，蒸發(fā)至20ml，放冷，加醋酸鹽緩沖液（pH3.5）2ml與水適量使成25ml，加硫代乙酰胺試液2ml，搖勻，放置2分鐘，與標準鉛溶液1.0ml加水19ml用同一方法處理后的顏色比較，不得更深（0.000 01%）。

微生物限度  采用下列方法，或經充分驗證的等同或更優(yōu)方法，進行微生物監(jiān)測。

    純化水取本品不少于1ml，經薄膜過濾法處理，采用R2A瓊脂培養(yǎng)基，30~35℃培養(yǎng)不少于5天，依法檢查（通則1105），1ml供試品中需氧菌總數不得過100cfu。可根據監(jiān)測數據適當調整檢驗量，以能夠監(jiān)測到微生物數量變化。

    純化水微生物限度標準為不大于100cfu/ml，注射用水微生物限度標準為不大于10cfu/100ml。應在滿足限度標準的前提下，設置適當的警戒限度和糾偏限度，以監(jiān)測不良趨勢。如用于高風險制劑或無菌工藝，可根據需要設定更嚴格的警戒限度和糾偏限度。

    除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節(jié)pH值使加熱滅菌后在25℃的pH值為7.2±0.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。

    R2A瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查試驗  照非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105）中“計數培養(yǎng)基適用性檢查”的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基的適用性檢查方法進行，試驗菌株為銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌。應符合規(guī)定。

【類別】溶劑、和稀釋劑。

【貯藏】密閉保存。

    注：基于風險評估，必要時，可按下述方法測定本品的不揮發(fā)物：取本品100ml，置105℃恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，并在105℃干燥至恒重，遺留殘渣不得過1mg。

1143  細菌內毒素檢查法凝膠檢測技術（包括方法1和方法2）

凝膠檢測技術系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理進行限度檢測或定量檢測內毒素的方法。

 

1.預備試驗

為保證凝膠試驗的準確性和有效性，按以下步驟開展鱟試劑靈敏度復核試驗和供試品的干擾試驗。

鱟試劑靈敏度復核試驗  在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。

根據鱟試劑靈敏度的標示值（λ），將細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘或參照標準品說明書中要求的混勻時間進行操作，然后制成至少包含2λ、λ、0.5λ和0.25λ 4個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒或參照標準品說明書中要求的混勻時間進行操作。取不同濃度的內毒素標準溶液，分別與等體積（如0.1ml）的鱟試劑溶液混合，每一個內毒素濃度平行做4管；另外取2管加入等體積的細菌內毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。

將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180°，若管內形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應避免受到振動，造成假陰性結果。

當最低濃度管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc）。

λc=antilg（ΣX/n）

式中  X為反應終點濃度的對數值（Ig）。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度；n為每個濃度的平行管數。

當λc在0.5λ~22（包括0.5λ和2λ）時，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

干擾試驗  按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作，并計算溶液C和溶液B的反應終點濃度的幾何平均值。

表1  凝膠檢測技術干擾試驗溶液的制備

 

注：A為供試品溶液；B為干擾試驗系列；C為鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。

只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，試驗方為有效。當系列溶液B的結果在0.5λ~2λ之間（包括0.5λ和2λ）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。其他情況則認為供試品在該濃度下存在干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。

可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗。

當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗。

當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。

 

2.凝膠限度法（方法1）

步驟 按表2制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數不超過MVD并且已經排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。

結果判斷 保溫60分鐘±2分鐘后觀察結果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。

表2  凝膠限度試驗溶液的制備

 

注：A為供試品溶液；B為供試品陽性對照；C為陽性對照；D為陰性對照。

若溶液A的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進行復試。復試時溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否則判定供試品不符合規(guī)定。

若供試品的稀釋倍數小于MVD而溶液A結果出現不符合規(guī)定時，可將供試品稀釋至MVD重新實驗，再對結果進行判斷。

 

3.凝膠定量法（方法2）

步驟  本方法系通過確定反應終點濃度來量化供試品中內毒素的含量。按表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。

表3  凝膠定量試驗溶液的制備

注：A為不超過MVD并且通過干擾試驗的供試品溶液。從通過干擾試驗的稀釋倍數開始用檢查用水稀釋如1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數不得超過MVD。

B為含2λ濃度標準內毒素的溶液A（供試品陽性對照）。

C為鱟試劑標示靈敏度的對照系列。

D為陰性對照。

計算及結果判斷 若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應終點濃度的幾何平均值在0.5λ~2λ，試驗有效。

系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數乘以λ，為每個系列的反應終點濃度。如果檢驗的是經稀釋的供試品，則將終點濃度乘以供試品進行定量試驗的初始稀釋倍數，即得到每一系列內毒素濃度c。

若每一系列內毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定供試品符合規(guī)定。每一系列內毒素濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度[按公式CE=antilg（Σlgc/2）]。若試驗中供試品溶液的所有平行管均為陰性，應記為內毒素濃度小于λ（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記為小于λ乘以供試品進行定量試驗的初始稀釋倍數）。

若任何系列內毒素濃度不小于規(guī)定的限值時，則判定供試品不符合規(guī)定。當供試品溶液的所有平行管均為陽性，可記為內毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數乘以λ。