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高效液相色譜法中，色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復(fù)性等五個(gè)參數(shù)。其中，分離度用于評(píng)價(jià)待測(cè)物質(zhì)與被分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關(guān)鍵指標(biāo)[1]。

2025藥典增加了峰谷比（p/v）作為衡量色譜系統(tǒng)分離效能的新指標(biāo)，與USP、EP藥典系統(tǒng)適用性要求保持一致[1,2,3,4]。這一變化不僅僅是為色譜分離效能的評(píng)估提供一種新的選擇，關(guān)鍵在于提升了色譜分離效能評(píng)價(jià)的科學(xué)性。

本文對(duì)比了峰谷比和分離度的計(jì)算公式，分析了分離度和峰谷比的適用場(chǎng)景，提出了制定峰谷比可接受標(biāo)準(zhǔn)的思路，旨在拋磚引玉，供同行借鑒參考。

2.峰谷比和分離度的計(jì)算公式：

峰谷比和分離度作為色譜分離效能的評(píng)價(jià)指標(biāo)，兩者在計(jì)算公式上有較大差異，見下表：

3.峰谷比和分離度的適用場(chǎng)景

分離度的計(jì)算是基于保留時(shí)間和峰寬，因此其計(jì)算數(shù)值容易受到峰寬的影響，對(duì)于異常峰或峰形不對(duì)稱時(shí)（如肩峰、拖尾峰、前沿峰），分離度的計(jì)算可能失真，因此分離度更適合評(píng)估基線分離時(shí)的整體效果。

峰谷比的計(jì)算是基于兩相鄰峰中小峰的峰高和兩峰間峰谷的高度比，因此更適用于待測(cè)物質(zhì)峰與相鄰峰之間未達(dá)到基線分離時(shí)的情形，此時(shí)峰谷比相比分離度，能更真實(shí)反映分離狀態(tài)。

SzabolcsFekete等人在研究SEC色譜分離時(shí)提出，分離度通常不適用于重疊峰和不對(duì)稱峰，且特別不適用于高度差異很大的部分分離峰，但峰高差異較大的情況在 SEC 中經(jīng)常出現(xiàn)，因此，為了克服分離度的局限性，SEC 中通?？紤]峰谷比。[5]

EvaTyteca等人在進(jìn)行色譜響應(yīng)函數(shù)（CRF）的研究中發(fā)現(xiàn)，基于峰谷比的CRF比基于分離度的CRF能更好地應(yīng)對(duì)峰不對(duì)稱。然而，一旦噪聲水平變得顯著，峰谷比就失去了優(yōu)勢(shì)。[6]

綜上：當(dāng)達(dá)到基線分離時(shí)，采用分離度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)較為合適。當(dāng)未達(dá)到基線分離時(shí)，且兩峰差異過大或峰拖尾時(shí)，采用峰谷比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)更科學(xué)。但當(dāng)基線噪音較大時(shí)，采用峰谷比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)將導(dǎo)致可靠性下降，此時(shí)應(yīng)選用分離度。

4.如何制定峰谷比的可接受標(biāo)準(zhǔn)

相較于分離度的基本要求“除另有規(guī)定外，待測(cè)物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)不小于1.5”，各國(guó)藥典的《高效液相色譜法》中并沒有對(duì)峰谷比提出模式化的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

那么，當(dāng)分離度無法真實(shí)反映實(shí)際分離效能時(shí)，企業(yè)應(yīng)當(dāng)如何合理制定峰谷比的可接受標(biāo)準(zhǔn)呢？下表列舉了從中國(guó)藥典以及EP藥典中隨機(jī)摘錄的一些典型實(shí)例[1,3]：

從上表可以看出，峰谷比的可接受標(biāo)準(zhǔn)幾乎是“天差地別、五花八門”。

因此，企業(yè)可依據(jù)具體品種的具體檢測(cè)項(xiàng)目、實(shí)際檢測(cè)條件以及分析方法開發(fā)的知識(shí)空間，擬定科學(xué)合理的標(biāo)準(zhǔn)，即：在分析方法的耐用性空間中，找到一個(gè)最差的分離條件，采用此條件進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證（準(zhǔn)確度、精密度、線性等），各項(xiàng)驗(yàn)證均滿足擬定的驗(yàn)證要求時(shí)，那么此條件下的峰谷比即為可接受的最低標(biāo)準(zhǔn)。

值得注意的是，依據(jù)分析方法開發(fā)的先驗(yàn)知識(shí)，若分析方法的關(guān)鍵分離峰不止一對(duì)（即：僅制定兩峰間的分離評(píng)價(jià)指標(biāo)，無法代表整體的分離效能）時(shí)，應(yīng)將所有的“關(guān)鍵分離峰”納入系統(tǒng)適用性要求，以保證通過系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的檢測(cè)條件始終具備通過驗(yàn)證時(shí)的性能，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

參考文獻(xiàn)：

[1]Chp2020

[2]USP43

[3]EP11

[4]Chp2025

[5]Quantitative description of the quality of size exclusion chromatography separations

[6]A universal comparison study of chromatographic response functions