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摘 要： 建立正交試驗(yàn)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合提取工藝的優(yōu)化方法。采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合中柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的含量，并通過L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)合主成分分析法優(yōu)化該中藥組合的乙醇提取工藝。3種成分在考察濃度內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.001 4～0.904 1 mg/mL。平均回收率為97.72%～101.62%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%～1.01%（n=6）。最終確定優(yōu)化提取工藝參數(shù)為6倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h。所得提取工藝有較好的可行性與可控性，可適用于工業(yè)化生產(chǎn)，為含揮發(fā)性成分的經(jīng)典名方開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)參考。

關(guān)鍵詞： 高效液相色譜法； 揮發(fā)性成分； 正交試驗(yàn)； 主成分分析； 乙醇提取工藝

中藥中的揮發(fā)性成分是由萜類、苯丙素類、脂肪酸類等成分組成的油狀物，是中藥辛味的重要藥性物質(zhì)基礎(chǔ)[1-2]。辛味中藥（含揮發(fā)性成分中藥）具有散、行、潤(rùn)、燥等功效，在表證和氣血阻滯等中醫(yī)病證治療方面應(yīng)用廣泛[3]。在國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中有83%的經(jīng)典名方含具有揮發(fā)性成分的中藥[3]。傳統(tǒng)湯劑主要以水煎煮為主，通過控制煎煮順序、芳香氣味強(qiáng)弱等方式保證辛味中藥的揮發(fā)油提取率。而傳統(tǒng)煎煮往往容易造成揮發(fā)油損失[4]，難以保證辛味中藥的療效及質(zhì)量穩(wěn)定性[5-6]?，F(xiàn)代工藝研究表明，采用乙醇提取可有效提高揮發(fā)性成分的提取率[7]，對(duì)中藥制劑的質(zhì)量控制和療效保障具有重要意義。“柴胡-桂枝-生姜”是柴胡桂枝湯、柴胡加龍骨牡蠣湯和柴苓湯等經(jīng)典名方中常見的辛味藥組合，其比例多為12∶4.5∶4.5。柴胡和解表里、疏肝升陽，桂枝發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈、助陽化氣，生姜解表散寒、溫中止嘔、溫肺止咳，三藥合用共奏解表清熱，調(diào)和表里之效[8?10]。該中藥組合中的揮發(fā)性成分為重要的活性成分，在制劑中發(fā)揮著重要作用。前期藥理研究表明，其揮發(fā)性成分通過調(diào)節(jié)炎癥因子水平減輕H1N1誘導(dǎo)的小鼠肺炎[11]。此外，中藥組合中的其他主要成分例如柴胡皂苷A、桂皮醛等在抗炎、抗病毒等方面均有良好的效果[12-13]。筆者建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定中藥組合中柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素含量的方法，并通過L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)合主成分分析法優(yōu)化中藥組合乙醇提取主要藥效成分的提取工藝參數(shù)[14]，以期為柴胡桂枝湯、柴胡加龍骨牡蠣湯等含揮發(fā)性成分中藥的經(jīng)典名方研究開發(fā)提供參考。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，美國安捷倫科技有限公司。電子天平：CPA225D型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司。數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。電熱鼓風(fēng)干燥箱：FXB101-2型，上海樹立儀器儀表有限公司。低溫循環(huán)（真空）泵：DLSB-ZC型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。LCD數(shù)顯加熱型圓盤磁力攪拌器：MS-H-ProT型，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司。柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）均為98%，批號(hào)分別為B20146、B21081、B21838，上海源葉生物科技有限公司。乙腈、甲醇：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司。中藥樣品：柴胡飲片產(chǎn)地為山東，批號(hào)為230301；桂枝飲片產(chǎn)地為廣東，批號(hào)為230102，均購自山東百味堂中藥飲片有限公司。生姜：市售。實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；柱溫：30 °C；檢測(cè)波長(zhǎng)：柴胡皂苷A為210 nm，桂皮醛為290 nm，6-姜辣素為225 nm；進(jìn)樣體積：25 μL；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為水，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～18 min 32% 乙腈，18～27 min 32%～38% 乙腈，27～41 min，38% 乙腈。

1.3 樣品溶液制備

對(duì)照品溶液：分別取柴胡皂苷A對(duì)照品、桂皮醛對(duì)照品、6-姜辣素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制得質(zhì)量濃度分別為1.146、4.601、0.414 mg/mL的對(duì)照品貯備溶液。樣品溶液：按照柴胡12 g、桂枝4.5 g、生姜4.5 g稱取藥材，加入6倍量70%乙醇加熱回流提取1 h，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。陰性對(duì)照溶液：“柴胡-桂枝-生姜”組合分別減去柴胡、桂枝、生姜單味藥材，采用樣品相同的制備方法，制備陰性對(duì)照溶液?？瞻兹芤海喝?0%乙醇過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取樣品溶液及對(duì)照品溶液，按照1.2儀器工作條件測(cè)定，以色譜峰面積外標(biāo)法對(duì)柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素進(jìn)行定量，然后通過L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)合主成分分析，綜合評(píng)價(jià)最佳提取工藝。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件選擇

參考《中華人民共和國藥典》（2020版）一部“柴胡”“桂枝”以及“生姜”的含量測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化[15]，分別選用乙腈-水溶液、乙腈-0.1% 甲酸水溶液、乙腈-0.1% 磷酸溶液為流動(dòng)相對(duì)柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素進(jìn)行考察。結(jié)果表明，采用乙腈-水溶液流動(dòng)相體系，對(duì)3種成分的色譜分離度良好且穩(wěn)定性強(qiáng)。將照品溶液在190～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，3種成分分別在210、290、225 nm下有較強(qiáng)吸收且分離度較好。將柱溫分別設(shè)置為25、30、35 ℃進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，相比在25、35 °C，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，色譜峰基線平穩(wěn)且柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的色譜峰分離度良好。

2.2 線性方程與檢出限

取質(zhì)量濃度分別為1.146、4.601、0.414 mg/mL的柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，得到系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2儀器工作條件進(jìn)行分析，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以3倍信噪比時(shí)對(duì)應(yīng)的溶液中柴胡皂苷 A、桂皮醛、6-姜辣素的質(zhì)量濃度作為方法檢出限和定量限。3 種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表1。由表1可知，3種成分在考察濃度內(nèi)與色譜峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法檢出限為0.001 4~0.904 1 mg/mL，表明該方法具有良好的靈敏度，適于定量。

 

表1   線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Tab. 1   Linear range, linear equation, correlation coefficient, and detection limit

 

2.3 方法專屬性

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、樣品溶液、缺柴胡陰性溶液、缺桂枝陰性溶液、缺生姜陰性溶液及空白樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進(jìn)樣分析，色譜圖如圖1所示。從圖1中可以看出，空白樣品溶液及陰性溶液中的成分對(duì)樣品溶液中3種成分的測(cè)定無干擾，表明該方法專屬性良好。

 

圖1   色譜圖Fig. 1   chromatograms

1—桂皮醛；2—柴胡皂苷A； 3—6-姜辣素

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照1.3方法制備樣品溶液，然后在第0、2、4、6、12、24 h時(shí)，按1.2儀器工作條件進(jìn)樣分析，記錄對(duì)應(yīng)色譜峰面積，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，樣品溶液在24 h內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

表2   穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab. 2   Stability test results

 

2.5 精密度試驗(yàn)

按1.3方法平行制備6份樣品溶液，在1.2儀器工作條件下進(jìn)樣分析，記錄對(duì)應(yīng)色譜峰面積，并計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。由表3可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%~1.01%，表明該方法精密度良好。

 

表3   精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab. 3   Precision test results

 

2.6 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密量取樣品溶液0.5 mL于2 mL容量瓶中，精密加入0.5 mL混合對(duì)照品溶液（其中柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的質(zhì)量濃度分別為0.433 3、0.473 0、0.047 2 mg/mL），用甲醇定容，搖勻，濾過，在1.2儀器工作條件下測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

 

表4   樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Tab. 4   Sample spiked recovery test results

 

由表4可知，實(shí)際樣品加標(biāo)的平均回收率為97.72%～101.62%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度，符合分析要求。

2.7 提取工藝優(yōu)化

2.7.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析以3種成分的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，提取溶劑（70%乙醇）量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）為3種考察因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用綜合加權(quán)評(píng)分法進(jìn)行分析，按照下式計(jì)算綜合評(píng)分：綜合評(píng)分 = （柴胡皂苷A含量/最高柴胡皂苷A含量）× 0.35 +（桂皮醛含量/最高桂皮醛含量）× 0.35+ （6-姜辣素含量/最高6-姜辣素含量）× 0.3，正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。由表6可知，3種因素影響程度依次為C（提取次數(shù)）＞A（提取溶劑量）＞B（提取時(shí)間），各因素對(duì)提取效率均有顯著影響（P < 0.05），表明加入6倍量70%乙醇，提取3次，每次提取1.5 h的提取效率高。

 

表5   L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Tab. 5   L9 (34) Orthogonal test results

 

表6   方差分析結(jié)果Tab. 6   Results of analysis of variance

 

2.7.2 液相圖譜信息主成分分析中藥成分復(fù)雜多樣，為了進(jìn)一步全面整體性評(píng)價(jià)“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合的提取工藝，采用指紋圖譜結(jié)合主成分分析進(jìn)行深入研究。“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合高效液相色譜 3D光譜圖如圖2所示，“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合于210 nm檢測(cè)波長(zhǎng)的色譜圖如圖3所示。

 

圖2   “柴胡-桂枝-生姜”中藥組合HPLC 3D光譜圖

Fig. 2   HPLC 3D spectrum of "Chaihu-Guizhi-Ginger" traditional Chinese medicine combination

 

圖3   “柴胡-桂枝-生姜”組合于210 nm檢測(cè)波長(zhǎng)的色譜圖

Fig. 3   Chromatogram of "Chaihu-Guizhi-Ginger" traditional Chinese medicine combination at a detection wavelength of 210 nm

 

1~18—共有特征色譜峰

從圖2、圖3中可以看出，在全波長(zhǎng)掃描下，于210 nm波長(zhǎng)處的色譜峰信息豐富，對(duì)其中的18個(gè)共有特征色譜峰進(jìn)行積分處理，以色譜峰面積為指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示前5個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為91.076%，可用于“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合的整體評(píng)價(jià)。各主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率、累計(jì)方差貢獻(xiàn)率及各主成分高載荷色譜峰[16]結(jié)果數(shù)據(jù)見表7。

 

表7   主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率、累計(jì)方差貢獻(xiàn)率及高載荷色譜峰

Tab. 7   Eigenvalues, variance contribution rates, and cumulative variance contribution rates of principal

 

將原始指標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算得5種主成分的得分，再根據(jù)各主成分的貢獻(xiàn)率，推導(dǎo)出主成分綜合評(píng)價(jià)線表達(dá)式為F=0.373 02Y1+0.221 63Y2+0.147 60Y3+0.099 15Y4+0.069 36Y5。根據(jù)表達(dá)式得出綜合得分，用于整體性評(píng)價(jià)提取工藝，結(jié)果見表8。由表8可知，5號(hào)工藝即6倍量70%乙醇提取3次，每次1.5 h，與正交試驗(yàn)結(jié)果相同，說明從整體評(píng)價(jià)提取工藝與測(cè)定指標(biāo)性成分柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素的含量評(píng)價(jià)提取工藝可相互對(duì)應(yīng)，使提取工藝更準(zhǔn)確、可靠[17-18]，因此5號(hào)工藝為最佳工藝。

 

表8   主成分得分和綜合得分Tab. 8   Principal component scores and comprehensive scores

 

2.8 提取工藝驗(yàn)證

依據(jù)篩選出的中藥組合最佳提取工藝參數(shù)，進(jìn)行3批驗(yàn)證性試驗(yàn)。結(jié)果表明，柴胡皂苷A、桂皮醛、6-姜辣素含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.23%、0.63%、0.60%，表明優(yōu)化方法準(zhǔn)確、合理、可靠。使用該提取工藝制備的3批樣品中的各指標(biāo)性成分含量穩(wěn)定，且提取率較高，表明此工藝條件重復(fù)性好，穩(wěn)定可行。

 

3 結(jié)論

建立了高效液相法同時(shí)測(cè)定“柴胡-桂枝-生姜”中藥組合中柴胡皂苷A、桂皮醛及6-姜辣素含量的方法，并對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，適用于3種成分含量的同時(shí)測(cè)定。采用乙醇提取解決了揮發(fā)性成分在提取時(shí)油水分離困難、提取率較低等問題，并在此基礎(chǔ)上，通過指標(biāo)性成分定量與色譜圖特征信息分析結(jié)合的方法對(duì)該中藥組合的乙醇提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用正交試驗(yàn)，以多個(gè)成分的含量為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)提取工藝，使所得結(jié)果具有準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)結(jié)合主成分分析，選擇多個(gè)代表性綜合指標(biāo)（主成分）代替原始變量，最大限度地保留樣本的原始信息并對(duì)樣本做出整體性評(píng)價(jià)，與中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)相契合。最終優(yōu)化提取工藝為6倍量70%乙醇提取三次，每次1.5 h。所建立的分析評(píng)價(jià)方法具有快速簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、結(jié)果精確度高的特點(diǎn)，可為含有揮發(fā)性成分的經(jīng)典方劑的進(jìn)一步開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

 

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17 何艷， 胡小祥， 王繼威， 等. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定銀花平感顆粒中10種成分的含量［J］. 中藥新藥與臨床藥理， 2024， 35（5）： 719.
    HE Yan， HU Xiaoxiang， WANG Jiwei， et al. Simultaneous determination of ten constituents in Yinhua Pinggan Granules by HPLC［J］. Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology， 2024， 35（5）： 719.

18 王賢兒， 譚娥玉， 張玉娥， 等. 天芷金黃凝膠膏劑制備工藝的優(yōu)化［J］. 中成藥， 2021， 43（11）： 3 125.
    WANG Xianer， TAN Eyu， ZHANG Yu’e， et al. Optimization of preparation technology of Tianzhi Jinhuang gel ointment［J］. Chinese Traditional Patent Medicine， 2021， 43（11）： 3 125.