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氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，對(duì)于生命活動(dòng)至關(guān)重要。因此，氨基酸檢測(cè)在生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

現(xiàn)有的氨基酸分析技術(shù)有高效液相色譜法(LC)、氣相色譜法(GC)、毛細(xì)管電泳法和離子交換色譜法。一般液相色譜或氣相色譜需進(jìn)行衍生化方可進(jìn)樣分析，LC與GC經(jīng)常與質(zhì)譜（MS）聯(lián)用對(duì)氨基酸進(jìn)行分析，一般無(wú)需進(jìn)行衍生處理。其中柱前衍生液相色譜法應(yīng)用較多，且有很多柱前衍生試劑， 如熒光胺(FA)、異硫氰酸苯酯(PITC)、6-氨基喹啉基-N-琥珀酰-亞胺基甲酸酯(AQC) 、氯甲酸芴甲酯(FMOC-CI) 、丹磺酰氯(Dansyl-CI) 、鄰苯二甲醛(OPA)、和2, 4-二硝基氟苯(DNFB)等。陽(yáng)離子交換色譜法是基于氨基酸在酸性條件下變成陽(yáng)離子并經(jīng)陽(yáng)離子交換色譜柱分離后，再與茚三酮發(fā)生衍生化反應(yīng)，產(chǎn)生能被紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)的紫色或深藍(lán)色或黃色衍生物。本文主要介紹衍生化反應(yīng)對(duì)氨基酸分析的應(yīng)用。

柱前衍生高效液相色譜法

由于氨基酸多數(shù)沒(méi)有紫外吸收，故需要經(jīng)過(guò)衍生化后產(chǎn)生紫外吸收。

在進(jìn)行色譜分離之前，需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)處理。如固體樣品需要進(jìn)行粉碎、混合和均勻化；液體樣品需要稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛?，以適應(yīng)色譜分離的需要。同時(shí)，需要消除樣品中的雜質(zhì)和干擾物質(zhì)，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。

熒光胺(FA)、異硫氰酸苯酯(PITC)等生化試劑能夠與氨基酸發(fā)生反應(yīng)，在原有氨基酸結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入其他基團(tuán)，使氨基酸存在紫外或熒光吸收并且增加其極性和親水性，使其更適合在反相色譜柱上分離。此外，衍生化反應(yīng)需要控制溫度、pH值等，以保證反應(yīng)的正常進(jìn)行。

圖1：PITC與氨基酸反應(yīng)方程式

衍生化后的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)液相色譜梯度洗脫（常用的色譜柱填料包括硅膠、C18、C8等反相色譜柱填料，流動(dòng)相一般為水-有機(jī)溶劑的混合物），即可產(chǎn)生相應(yīng)的峰，且靈敏度較高，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)氨基酸高效、準(zhǔn)確和高靈敏度的分析，為氨基酸相關(guān)研究提供有力支持。

圖2：液相色譜柱前衍生氨基酸測(cè)定色譜圖（PITC與氨基酸反應(yīng)后進(jìn)樣）

柱后衍生色譜法

柱后衍生是指將經(jīng)過(guò)色譜分離后的氨基酸與適當(dāng)?shù)难苌噭┘訜幔D(zhuǎn)化為適合檢測(cè)的形式，以提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性。常用的衍生試劑有茚三酮、鄰苯二甲醛、9-芴甲基氯甲酸酯等。

氨基酸分析儀利用經(jīng)典的茚三酮柱后衍生法來(lái)分析水解蛋白和生理液中的氨基酸，可對(duì)目前關(guān)注的所有氨基酸進(jìn)行定性定量檢測(cè)。氨基酸分析儀所使用的是陽(yáng)離子交換色譜-柱后茚三酮衍生的方法對(duì)氨基酸進(jìn)行分析，注射的樣品經(jīng)陽(yáng)離子分離柱分離后，與持續(xù)進(jìn)入系統(tǒng)的茚三酮混合衍生后，經(jīng)紫外檢測(cè)器檢測(cè)出信號(hào)出峰。

氨基酸分析儀所使用的是Na+型(或Li+型)磺酸基強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。氨基酸離子和強(qiáng)酸性活性基團(tuán)（－SO3-）之間的相互作用。由于氨基酸為兩性電解質(zhì),在酸性條件下呈+H2N-CHRCOOH狀態(tài)，能被樹(shù)脂表面的活性基團(tuán)（－SO3-）吸附，通過(guò)淋洗液pH的變化使氨基酸被逐一淋洗下來(lái)。酸性氨基酸與活性基團(tuán)親和力最弱最先被淋洗下來(lái)，其次是羥基氨基酸和中性氨基酸，然后是芳香族氨基酸，堿性氨基酸最后被淋洗出來(lái)。Na+型樹(shù)脂一般用于蛋白質(zhì)水解液中的氨基酸分析，Li+型樹(shù)脂一般用于生理體液中的氨基酸分析。Na+型樹(shù)脂一般可用于18種氨基酸的測(cè)定，Li+型樹(shù)脂一般可用于34種氨基酸的分析測(cè)定。

伯氨型氨基酸在與茚三酮反應(yīng)的過(guò)程中，會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)，從而脫去氨基和羧基，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛。同時(shí)，茚三酮在這一過(guò)程中被還原為還原茚三酮。隨后，這種還原茚三酮與另一個(gè)茚三酮以及氨發(fā)生反應(yīng)，生成一種藍(lán)紫色物質(zhì)，其最大吸收波長(zhǎng)為570nm。

圖3 伯氨型氨基酸與茚三酮反應(yīng)

仲氨型氨基酸，如脯氨酸和羥基脯氨酸等，在與茚三酮反應(yīng)時(shí)，并不會(huì)釋放NH3，而是直接生成黃色的化合物。這種化合物的最大吸收波長(zhǎng)在400nm，二級(jí)最大吸收在440nm（由于440nm波長(zhǎng)的能量更為穩(wěn)定，因此最終選擇該波長(zhǎng)）。反應(yīng)后的混合物流入雙通道光度計(jì)，通過(guò)雙波長(zhǎng)(570 nm和440 nm) 同時(shí)連續(xù)測(cè)量。

圖4 仲氨型氨基酸與茚三酮反應(yīng)

圖5 氨基酸分析儀柱后衍生氨基酸測(cè)定色譜圖

經(jīng)過(guò)對(duì)比氨基酸分析儀與液相色譜方法，發(fā)現(xiàn)兩者的靈敏度相當(dāng)，但在分析時(shí)間上，氨基酸分析儀相對(duì)較長(zhǎng)。雖然氨基酸分析儀和液相色譜儀都能實(shí)現(xiàn)基線分離，但氨基酸分析儀的價(jià)格較高，并且所需的試劑純度要求也較高，特別是茚三酮這種試劑價(jià)格昂貴，且在市場(chǎng)上較難獲得。與此相反，液相色譜儀更為普遍，而氨基酸分析儀僅限于氨基酸分析，導(dǎo)致其實(shí)用性相對(duì)較差。因此，目前氨基酸測(cè)定的主流方法是液相色譜柱前衍生，而氨基酸分析儀的使用則相對(duì)較少。