中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

除了對每批次的單克隆抗體進(jìn)行常規(guī)的放行檢測之外，對使用臨床試驗樣品生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行進(jìn)一步的生物化學(xué)和生物物理學(xué)上的表征，對于全面了解單克隆抗體產(chǎn)品的詳細(xì)結(jié)構(gòu) 特征，并鑒定關(guān)鍵質(zhì)量屬性是至關(guān)重要的。這些詳細(xì)的表征數(shù)據(jù)還可以用于支持產(chǎn)品制劑處方的 開發(fā)，有助于證明工藝放大、工藝變更或者廠房變更后的產(chǎn)品可比性。不需要對每批次的單克隆抗體都進(jìn)行表征研究，而且本文中所述的分析方法也并非都需要在臨床I 期研究之前進(jìn)行。

用于表征單克隆抗體產(chǎn)品的分析方法應(yīng)盡可能完整的描述產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和變化。從表4.9 中 列出的常用的表征單克隆抗體產(chǎn)品的分析方法的清單中可以看出，某些分析方法既可以用于產(chǎn)品 的表征，也可以用于放行測試。比如，肽圖分析可以用作常規(guī)的鑒定測試，因為它可以確證單克 隆抗體產(chǎn)品的一級結(jié)構(gòu)。同時，肽圖還可以提供有關(guān)單克隆抗體的更為詳細(xì)的表征信息，比如抗 體中二硫鍵的確認(rèn)，是否存在降解產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)的氧化或者脫酰胺形式，以及各種翻譯后的位 置和結(jié)構(gòu)修飾，比如糖基化。另一種常用于放行和表征的分析方法是質(zhì)譜分析。除了確認(rèn)正確的 分子量，蛋白序列和翻譯后修飾之外，質(zhì)譜分析還可以用于鑒定單克隆抗體存在其他產(chǎn)品相關(guān)或 者不相關(guān)的蛋白，并為肽圖分析確定的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)信息提供正交的確認(rèn)。

 

 

1 蛋白結(jié)構(gòu)的表征

 

1.1 氨基酸序列分析

氨基酸分析可以鑒定和定量蛋白質(zhì)樣品中存在的大多數(shù)的氨基酸，樣品通常要經(jīng)過酸水解 法破壞各個氨基酸之間的肽鍵。酸水解通常使用6 N 的鹽酸在100℃下處理16-24 小時。釋放單 個氨基酸后，可以在色譜分離之前或者之后進(jìn)行衍生化，然后進(jìn)行在線檢測。通過與同時運行的 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較來鑒定和定量氨基酸。盡管這是大多數(shù)蛋白質(zhì)分析實驗室中常用的常規(guī)方法，但 是此方法也有缺點，就是對某些氨基酸分析不準(zhǔn)確。含有酰胺鍵的氨基酸，比如天冬酰胺和谷氨 酰胺，會被轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的酸形式，天冬氨酸和谷氨酸，而無法最終單獨測定。一些其他的氨基酸， 比如絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸，會因為苛刻的降解條件而發(fā)生部分降解，因此無法 準(zhǔn)確定量。一種氨基酸，色氨酸，會被常用的酸水解方法而破壞。

 

1.2 N 端和C 端序列分析

證明單克隆抗體具有正確的N 端和C 端是確認(rèn)產(chǎn)品的一級結(jié)構(gòu)以及確定是否存在不同形式 加工的抗體形式的另一種分析方法。C 端的賴氨酸變體和N 端的前導(dǎo)肽序列的不完全切割是單克 隆抗體產(chǎn)品常見的變異體，這種變異體可以通過N 端和C 端序列分析來檢測的。這些變異體是可 接受的，但是要進(jìn)行檢測以確保在整個工藝開發(fā)過程中，不同規(guī)模的或者不同的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的 單克隆抗體產(chǎn)品批次之間的一致性。如果N 端沒有被谷氨酸殘基環(huán)化形成的焦谷氨酸封閉，那么 通常可以使用標(biāo)準(zhǔn)的Edman 降解方法對完整單克隆抗體進(jìn)行N 末端測序。通常要測定重鏈和輕 鏈的N 端5-10 個氨基酸殘基，并將所得的序列與單克隆抗體產(chǎn)品產(chǎn)物的預(yù)期序列進(jìn)行比較。測定C 端的氨基酸序列則通常需要將蛋白質(zhì)降解為小肽，然后對小肽進(jìn)行測序，這里面即存在重鏈和 輕鏈的C 末端。通常作為整個單克隆抗體肽圖分析的一部分來進(jìn)行。

相比于單條鏈的蛋白質(zhì)，單克隆抗體產(chǎn)品中含有兩條蛋白鏈?zhǔn)沟脤π蛄袛?shù)據(jù)的解釋更加困 難。另外，無法使用Edman 降解法對焦谷氨酸測序，因此通過該方法無法檢測到含有焦谷氨酸的 重鏈的N 端序列，但是可以在肽圖中確定C 端序列。重鏈序列的缺失不能證明焦谷氨酸的存在， 但這是最可能的原因。因此，N 端測序通常為定性檢測，以確認(rèn)是否存在預(yù)期的序列，而不是對 每個存在的序列進(jìn)行定量。在一些或者全部重鏈的N 端含有焦谷氨酸的情況下，可以通過肽圖分 析來確定N 端序列。

 

1.3 肽圖分析

如上面所講，肽圖分析可以用來確認(rèn)單克隆抗體產(chǎn)品的一級結(jié)構(gòu)，但是它也可以鑒定因降 解，比如脫酰胺或者氧化，而導(dǎo)致的單個氨基酸變化。肽圖分析還可以用于確定單克隆抗體產(chǎn)品 中二硫鍵的位置和糖基化位點。單克隆抗體產(chǎn)品的肽圖分析可以視為蛋白質(zhì)的指紋圖譜，提供了 對該蛋白質(zhì)的全面的理解。

當(dāng)用于表征研究時，肽圖分析應(yīng)確認(rèn)至少包含了90%的蛋白質(zhì)序列，單克隆抗體的肽圖分 析可能使用不止一種酶來消化蛋白質(zhì)。與序列相關(guān)，單克隆抗體的某些部分可能無法被酶消化， 從而導(dǎo)致肽段太大而無法被鑒定。另外的部分也有可能被徹底消化成了單個氨基酸，這些氨基酸 在分離肽段的色譜中無法保留。翻譯后修飾的存在還可能是抗體的某些部分對酶消化產(chǎn)生抗性， 因此需要在消化和肽圖分析之前將蛋白質(zhì)進(jìn)行去糖基化處理。

 

1.4 游離的巰基和二硫鍵

在正常的條件下，IgG1 單克隆抗體含有四個鏈間二硫鍵，其中兩個將輕鏈與重鏈連接，兩 個將兩條重鏈彼此連接。其他IgG 的鏈間二硫鍵的數(shù)目略有不同，但是所有的IgG 均通過二硫鍵連 接在一起。在可變區(qū)和恒定區(qū)也會發(fā)現(xiàn)額外的鏈間二硫鍵，它們有助于穩(wěn)定單克隆抗體的三維結(jié) 構(gòu)。盡管單克隆抗體上所有的半胱氨酸殘基都應(yīng)以二硫鍵配對，但是一個或多個二硫鍵還是可能 被還原，從而導(dǎo)致單克隆抗體產(chǎn)品中游離的巰基含量較低。這些游離的巰基可與另一個抗體分子 中的游離巰基反應(yīng)，導(dǎo)致二聚化和多聚化，從而影響單克隆抗體此產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

單克隆抗體產(chǎn)品中的半胱氨酸殘基是否配對成二硫鍵可以通過在還原和非還原條件下產(chǎn)品 的肽圖分析來確定。將單克隆抗體去糖基化，去除蛋白質(zhì)主鏈上的碳水化合物后，其中的一份樣 品用4- 乙烯基吡啶烷基化， 胰蛋白酶或者其他合適的酶消化， 經(jīng)過HPLC 分離進(jìn)行質(zhì)譜分析 （LC/MS）檢測。另一份的樣品先用二硫蘇糖醇（DTT）還原，用4-乙烯基吡啶烷基化，用相同的 酶消化并通過LC / MS 分析。通過比較所得的兩個肽圖，可以鑒定出含有通過二硫鍵配對的半胱氨 酸殘基的肽段。對于單克隆抗體產(chǎn)品，含有許多的二硫鍵，通過還原前收集分離的肽段，可以更 容易的確定在二硫鍵中配對的半胱氨酸殘基。對還原和非還原兩種情況獲得肽圖分析，可以清楚 的確定哪個兩個半胱氨酸配對成了特定的二硫鍵。

正確折疊的單克隆抗體產(chǎn)品不應(yīng)該存在游離的巰基?？梢酝ㄟ^使用Elman 試劑（DTNB）處 理單克隆抗體產(chǎn)品來確定產(chǎn)品中的游離巰基的存在程度。Elman 試劑與單克隆抗體中的游離巰基 反應(yīng)，生成對硝基苯酚，該物質(zhì)在412nm 處有非常強(qiáng)的吸收。在進(jìn)行DTNB 處理之前，需要使用 溫和的變性劑處理來破壞單克隆抗體產(chǎn)品的三維結(jié)構(gòu)，以將所有的游離的巰基暴露于Elman 試劑。反應(yīng)結(jié)束后，測定在412nm 處的吸光度值，扣除412nm 處的背景吸收，然后除以13600（對硝基 苯酚的消光系數(shù)），以此來定量存在的游離巰基。Elman 試劑可以用許多其他的反應(yīng)試劑來代替， 這些反應(yīng)試劑都是特異的結(jié)合游離巰基，然后轉(zhuǎn)換為比色或者熒光測定，即使存在過量的未結(jié)合 試劑情況下仍可定量游離巰基含量。

 

1.5 內(nèi)源性和激發(fā)性熒光色譜

內(nèi)源性熒光光譜（IFS）可以提供有關(guān)單克隆抗體產(chǎn)品的三級結(jié)構(gòu)的定量信息。在這個方法 中，蛋白質(zhì)被近紫外到藍(lán)光波長的激光激發(fā)，可誘導(dǎo)單克隆抗體中的色氨酸殘基發(fā)出特征性的熒 光，這反映了每個色氨酸殘基周圍的微環(huán)境。單克隆抗體產(chǎn)品的固有熒光對蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu) 非常敏感，因為變性、降解或者聚集導(dǎo)致的三級結(jié)構(gòu)變化都會導(dǎo)致固有熒光的最大波長或者強(qiáng)度 發(fā)生變化。因為三級結(jié)構(gòu)與固有熒光之間沒有絕對的關(guān)系，因此不可能從熒光信息中得到抗體結(jié) 構(gòu)的信息。但是，該方法在評估強(qiáng)制條件下蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化中非常有用，并且經(jīng)常用于分 析抗體的強(qiáng)制降解樣品，作為抗體產(chǎn)品穩(wěn)定性研究的一部分工作。該方法可以用于制劑研究和對 生物類似藥的評估。

也可以通過使用與某些氨基酸（比如色氨酸）特異性結(jié)合的熒光探針來定量激發(fā)性熒光。但是探針的結(jié)合可能會破壞單克隆抗體的結(jié)構(gòu)，因此還是傾向于使用內(nèi)源性熒光測量作為研究單 克隆抗體三級/四級結(jié)構(gòu)的方法。

 

1.6 核磁共振

核磁共振波譜（NMR）通過檢測原子核之間的相互作用來測定相互作用的結(jié)構(gòu)信息。NMR 通過分析每個質(zhì)子旋轉(zhuǎn)引起的磁化強(qiáng)度來提供蛋白質(zhì)原子分辨率級別的結(jié)構(gòu)信息。NMR 分析高度 依賴于技術(shù)和軟件，因此需要昂貴的設(shè)備和大量的計算機(jī)分析才能對數(shù)據(jù)進(jìn)行反卷積，然后確定 哪些氨基酸側(cè)鏈對于抗體大分子的相互作用有影響。如果可以使用C13 或者N 標(biāo)記抗體，則有助 于抗體的研究。蛋白質(zhì)的標(biāo)記通?？梢酝ㄟ^在富含這些同位素化合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物來 實現(xiàn)。盡管NMR 不常用研究單克隆抗體的結(jié)構(gòu)，但是可以用于研究抗體與目標(biāo)分子之間的相互作 用。比較結(jié)合前后的NMR 光譜有助于確定哪些氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)墙咏Y(jié)合于結(jié)合區(qū)域的。

NMR 最大的優(yōu)點是可以用于分析溶液中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，盡管溶液中蛋白質(zhì)濃度要求要足 夠的高（0.05-1.0 mM）才能獲得有用的結(jié)果。這是一種非破壞性的方法，意味著樣品可以進(jìn)行 二次分析。NMR 的分析結(jié)果可以快速獲得，盡管只是部分獲得，但是非常有用的。目前NMR 還 無法分析分子量大于40kDa 的蛋白質(zhì)，因此通常用于分析小分子量的蛋白質(zhì)。

 

1.7 質(zhì)譜

質(zhì)譜分析（MS）是通過多種方式在蛋白質(zhì)上產(chǎn)生電荷，然后通過磁場和/或電場加速帶電 的蛋白質(zhì)來分離抗體。蛋白質(zhì)的加速度正比于其質(zhì)荷比，然后在檢測器中被俘獲。蛋白質(zhì)的電 離可以通過稀有氣體的原子轟擊（快速原子轟擊，F(xiàn)AB），激光電離（基質(zhì)輔助激光解離，MALDI） 或者電噴霧電離（ESI）來實現(xiàn)。還有其他可以使抗體蛋白質(zhì)帶電荷的方法，但是上述這些是最常 見的。帶電離子通過分析儀加速，通常是飛行時間（TOF）或者四級桿類型。飛行時間（TOF）質(zhì) 譜儀是指可以在電場中加速帶電蛋白質(zhì)，從而使每個具有相同電荷的分析具有相同的能量。分子 的飛行速度僅僅取決于蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比。每種分析類型都有不同的適用范圍，適用于某些不同的 電離方法。比如，TOF 分析儀可以適用于ESI 或者M(jìn)ALDI，而四極桿分析儀則不適用于MALDI 電離 樣品。檢測器通常為光電倍增器或者電子倍增器。質(zhì)譜儀的類型通常使用電離器和分析器類型來 描述，比如MALDI-TOF 質(zhì)譜。檢測器記錄捕獲的帶電粒子，并根據(jù)加速模式來計算質(zhì)荷比（m/z）， 通過合適的計算機(jī)軟件，就可以將其轉(zhuǎn)換為原始分子的質(zhì)量。MS 可以和諸如高效液相色譜（HPLC） 之類的分離方法組合使用，先將樣品的組分進(jìn)行分離，然后確定每種組分的分子量。之前，這種 方法費時又費力，限制了其實用性。但是，現(xiàn)代質(zhì)譜儀以及配合其解釋結(jié)果而開發(fā)的軟件系統(tǒng) 使得該方法更易于使用，目前已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。氫氘交換（HDX）功能標(biāo)記和片段分離技術(shù) 可以與MS 結(jié)合使用用來鑒定蛋白質(zhì)表面殘基。

質(zhì)譜分析可以提供有關(guān)抗體分子量的準(zhǔn)確信息，但是必須要注意選擇合適的方法來使蛋白 質(zhì)離子化，并選擇加速離子化物質(zhì)的條件。能量過高的電離可能會導(dǎo)致單克隆抗體分解為重 鏈和輕鏈，甚至有可能片段化抗體。質(zhì)譜儀的輸出結(jié)果包含一系列的峰，代表了所檢測到的質(zhì)量， 但是峰的高度與單獨的蛋白質(zhì)的含量并不成比例，因此該方法無法提供定量檢測的結(jié)果。質(zhì)譜圖 中的峰高與離子數(shù)量成正比，但是離子數(shù)量與蛋白質(zhì)的離子化程度、離子化形式的穩(wěn)定性以及通 過質(zhì)譜儀加速的程度有關(guān)。為了能夠定量各種蛋白質(zhì)，需要將MS 分析與輸出結(jié)果與蛋白質(zhì)含量 成正比的方法，比如反相HPLC 結(jié)合使用。這種分離方法需要開發(fā)工作，以便使其適用于MS 檢測 以及大多數(shù)的HPLC 方法所用的UV 檢測。通常用于反相HPLC 的三氟乙酸不適用于MS 樣品，因此 需要開發(fā)其他的緩沖液系統(tǒng)。

除了確定抗體的完整分子量之外，還可以通過使用激發(fā)能使抗體片段化來獲得其序列的數(shù) 據(jù)。使用兩個直接連接的質(zhì)譜儀（MS/MS），以足夠的能量來轟擊蛋白質(zhì)，從而使抗體產(chǎn)生多個 蛋白質(zhì)片段。這些片段被加速，然后單獨的片段再使用額外的能量轟擊產(chǎn)生二級片段，在第二個MS 中被加速和檢測。使用專門的軟件，可以通過檢查所檢測到的片段并發(fā)現(xiàn)哪些片段與已知單獨 氨基酸的分子量片段的區(qū)別來確定肽段序列。這些都可以足夠快的完成，以便可以在第二次激發(fā) 中檢測第一次激發(fā)中產(chǎn)生的大多數(shù)片段。當(dāng)今MS/MS 設(shè)備的高質(zhì)量和高靈敏度甚至可以提供有關(guān) 氧化或者脫酰胺以及一級結(jié)構(gòu)方面的信息。

 

1.8 等電聚焦

上面描述的等電聚焦分析方法，如果不用于產(chǎn)品的放行檢測，則通常用于蛋白質(zhì)的表征研 究。該技術(shù)具有非常高的分辨率，能夠分離僅有一個電荷差異的蛋白質(zhì)至單獨的條帶中。因此， 該方法非常適合用于測定單克隆抗體產(chǎn)品的電荷異構(gòu)體，還可以監(jiān)測產(chǎn)品的脫酰胺、氧化和唾液 酸化程度。盡管該方法可以測定抗體的電荷異質(zhì)性，但是沒有辦法來驗證異構(gòu)化的位點，必 須與另一種方法，比如肽圖分析，結(jié)合使用來鑒定氧化或者脫酰胺的位點。

 

1.9 圓二色譜

圓二色性（CD）是一種光吸收現(xiàn)象，代表的是左右圓偏振光的差異吸收。圓二色譜（CD） 就是基于分子，比如抗體在遠(yuǎn)紫外區(qū)域（190-250nm）或近紫外區(qū)域（230-250nm）影響左右偏振 光的方式的差異。這些差異的產(chǎn)生就是因為抗體，和所有的蛋白一樣，在結(jié)構(gòu)上的不對稱性。單 克隆抗體，如果沒有有序的結(jié)構(gòu)，則不會產(chǎn)生強(qiáng)度信號。有序的結(jié)構(gòu)則可能產(chǎn)生正的或者負(fù)的CD 信號。從這些區(qū)域的CD 光譜上獲得的信息是不同的。遠(yuǎn)紫外CD 對二級結(jié)構(gòu)更為敏感，而近紫外CD 光譜對三級結(jié)構(gòu)更為敏感。

CD 可以用于測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。通常可以用于確定折疊或者突變對蛋白質(zhì)的影響以 及用來研究蛋白質(zhì)之間相互作用。在遠(yuǎn)紫外區(qū)域，α-螺旋，β-折疊或無規(guī)卷曲通常具有良好并且 獨特的CD 光譜。單克隆抗體產(chǎn)品在遠(yuǎn)紫外區(qū)域的CD 光譜則反映了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的每個光譜所代 表的蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)量。該方法還可以用于評估抗體微環(huán)境的改變?nèi)绾斡绊懫涠壗Y(jié)構(gòu)。這些微環(huán) 境可包括不同的緩沖液pH 或者溶液的滲透壓。與遠(yuǎn)紫外CD 不同，近紫外CD 光譜與特定的蛋白 結(jié)構(gòu)之間沒有直接的關(guān)聯(lián)。近紫外CD 光譜區(qū)域取決于芳香族氨基酸，比如酪氨酸、苯丙氨酸和色 氨酸、半胱氨酸的吸收和其微環(huán)境。CD 一般不常用于放行測試，但是CD 可用于比較不同批次的 單克隆抗體的二級結(jié)構(gòu)，還可以用于制劑處方和制劑工藝的開發(fā)。

CD 是一種樣品無損的分析技術(shù)，可以對樣品進(jìn)行再分析。它要求樣品的濃度要稍高，如0.5-1.0mg/ml。CD 可以快速的獲得結(jié)果，并且可以在各種條件下，比如不同的pH 和溫度下進(jìn)行研究。單克隆抗體產(chǎn)品的分析很大程度上依賴于已知結(jié)構(gòu)的蛋白衍生的參照光譜的經(jīng)驗，因此， 一個成功的CD 分析是取決于所使用的參考數(shù)據(jù)庫的。

 

1.10 傅立葉變換紅外光譜

傅里葉紅外光譜（FTIR）也是用于分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的。紅外光譜法測量入射能量與 分子內(nèi)的電偶極相互作用時在特定能量下吸收的入射紅外輻射（0.78-1000um)。FTIR 依賴于紅 外光譜學(xué)基礎(chǔ)，也就是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與相關(guān)紅外波段條帶之間的關(guān)系。FTIR 儀器與先進(jìn)的數(shù)學(xué)分析方法相結(jié)合，可以分離重疊的IR 波段。FTIR 提供了有關(guān)抗體蛋白高度結(jié)構(gòu)化區(qū)域，比如α螺 旋或β折疊的存在和相對數(shù)量的信息。結(jié)構(gòu)化區(qū)域影響抗體的酰胺鍵區(qū)域的紅外光譜的吸收。通過 對已知二級結(jié)構(gòu)含量的蛋白質(zhì)的研究結(jié)構(gòu)分析，可以將FTIR 數(shù)據(jù)與各種結(jié)構(gòu)域的含量相關(guān)聯(lián)。FTIR 相對于其他檢測二級結(jié)構(gòu)的分析方法一個優(yōu)勢是它對固體制劑的適用性。該方法還可以應(yīng)用 于凍干或者噴霧干燥的樣品來評估多種制劑處方。

 

1.11 多角度激光散射

多角度激光散射（MALLS）提供了有關(guān)單克隆抗體產(chǎn)品聚集體和降解體的數(shù)量和性質(zhì)的信 息。對于聚合物，比如PEG 偶聯(lián)的抗體，MALLS 也可以很好的估計其真實大小，而SDS-PAGE 或者SEC 是不能看到的。

 

1.12 差示量熱掃描

單克隆抗體也可以通過差示量熱掃描方法（DSC）來進(jìn)行表征研究。與FTIR 類似，DSC 提 供的是有關(guān)抗體熱穩(wěn)定性的信息。通過測定影響樣品相變所需的能量，DSC 提供了有關(guān)不同制劑 中的單克隆抗體的比較信息。折疊成熱力學(xué)最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的單克隆抗體要比結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定程度高或者 具有不穩(wěn)定的三級/四級結(jié)構(gòu)的抗體需要更多的能量來展開。相變溫度（Tm），也就是樣品中50% 的分子未折疊點的溫度是產(chǎn)品三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的函數(shù)。單克隆抗體的折疊和解折疊發(fā)生在分子中 的多個位置，從而導(dǎo)致會有多個熱轉(zhuǎn)變點。由于單克隆抗體產(chǎn)品的Tm 可能會受到產(chǎn)品所用的制 劑的影響，因此DSC 也可以作為篩選和優(yōu)化單克隆抗體產(chǎn)品制劑處方的重要工具。

 

1.13 表征蛋白結(jié)構(gòu)的其他分析方法

盡管在臨床I 期之間很少使用，但是還是有其他的幾種分光光度法可以用于表征單克隆抗 體產(chǎn)品。測定UV 光譜的二階導(dǎo)數(shù)可以提供有關(guān)抗體純度的信息。FTIR 和CD 可以提供有關(guān)抗體的 二級結(jié)構(gòu)的信息。每種單克隆抗體的芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）的含量可能不 同，從而導(dǎo)致該抗體在近紫外區(qū)域（250-350nm）內(nèi)的特征光譜有所不同。通過測定光譜的二階 導(dǎo)數(shù)，可以確定該光譜是由于單個純分子還是兩個或者多個光譜組合的結(jié)果，從而表明是否存在 雜質(zhì)。

另一種常見的降解途徑是天冬酰胺的脫酰胺，可以通過市售的試劑盒來測定48 。該方法確 定異天冬氨酸的含量主要是基于當(dāng)異天冬氨酸與異麥芽糖基甲基轉(zhuǎn)移酶（PIMT）一起時可以酶促 催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)化為S-腺苷高半胱氨酸（SAH）。SAH 的含量即等于轉(zhuǎn)化的異天冬 氨酸的含量，然后通過HPLC 進(jìn)行分離和檢測。通過與同時運行的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定SAH 的濃度。該 方法適用于定量天冬酰胺的脫酰胺含量，因為異天冬氨酸主要通過脫酰胺產(chǎn)生。不過要注意的是， 由于溶液的pH 和周圍的氨基酸序列可能會影響生成的異天冬氨酸和天冬氨酸的比例。

 

2 聚集體的表征

單克隆抗體產(chǎn)品原液和制劑中的聚集體是影響產(chǎn)品活性和安全性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。上文討 論的尺寸排阻色譜法和SDS-PAGE 可用于常規(guī)的檢測單克隆抗體聚集體。為了更詳細(xì)的表征單克隆 抗體產(chǎn)品，精細(xì)的分析方法，比如多角度激光散射（MALLS）、分析型超速離心（AUC）和非 對稱快速超濾（FFF）等，則可以使用。

MALLS 利用的溶液中的蛋白質(zhì)對已知光散射的行為。以光源為直線，從零角度散射的光量 與溶液中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量成正比。零角度光因為被光源淹沒，無法測量，因此MALLS 儀器測量的 是一定角度（＞3）散射的光，并使用此數(shù)據(jù)來計算溶液中分子的平均分子量。該方法能夠在單一 溶液中鑒定出多種不同分子量的分子，因此不需要事先使用SEC 來分離抗體。MALLS 也可以用于 確定從SEC 分離出的峰上分子量，這就可以提供有關(guān)分離的高分子量形式的分子是二聚體、三聚 體還是多聚體形式的信息。為了獲得有關(guān)單克隆抗體聚集體形式的性質(zhì)和數(shù)量的最多信息， 將SEC 與UV 和 MALLS 檢測結(jié)合使用既可以定量蛋白質(zhì)的峰，又可以鑒定出每個峰中的分子的分子量 信息。

AUC 是基于蛋白質(zhì)或者其他聚合物在離心場中通過梯度溶液的遷移率來分析。該遷移率是 所研究抗體的分子半徑的函數(shù)。盡管AUC 不適合于質(zhì)量控制，而且由于其精度差而易于驗證，但 是在確定單克隆抗體及其相關(guān)產(chǎn)品形式的分子量時，AUC 仍是一個金標(biāo)準(zhǔn)，同時也可以用于確定 抗體的結(jié)合常數(shù)。AUC 數(shù)據(jù)分析的前提是基于單克隆抗體產(chǎn)品分子半徑與其分子量時直接相關(guān)的。只需要少量的樣品，AUC 即可分析共價和非共價的聚集體。盡管可以確定較大的分子量范圍，但 是在高濃度抗體溶液中，AUC 的檢測并不是特別理想，因此需要稀釋樣品，這可能會導(dǎo)致可逆聚 集體的解離。AUC 數(shù)據(jù)的分析需要專門的軟件將沉降速率轉(zhuǎn)換為分子量信息，而對數(shù)據(jù)的解釋則 需要專門的人員培訓(xùn)。

非對稱快速超濾也可以同時分析出共價和非共價的聚集體。FFF 分離是通過施加垂直于樣 品通過狹窄通道的流場將溶質(zhì)分層固定在膜上來實現(xiàn)。分子沿著流動路徑的運動是所分離的分子 的分子量的函數(shù)。由于沒有柱分離，因此該方法不能分離非常大的分子，并且難以看到0.15um 范 圍內(nèi)的聚集體和顆粒 73 。與AUC 一樣，該方法的精密度較差，難以驗證，不適合QC 使用。樣品 與膜之間的相互作用現(xiàn)在尚未有很好的理解和控制，可能是導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確的原因。

 

3 糖型的表征

單克隆抗體產(chǎn)品表征的一個關(guān)鍵部分是確定分子中的碳水化合物含量，包括單糖的數(shù)量和 類型，確定蛋白質(zhì)上碳水化合物鏈的定位以及單克隆抗體上存在的各種聚糖的寡糖模式，確定每 個糖鏈結(jié)構(gòu)中末端存在的唾液酸含量和類型。確定單克隆抗體產(chǎn)品上存在的寡糖是N 糖或者O 糖也非常重要。哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體通常在每條重鏈的CH2 區(qū)域的Asn297 上存在 一個N-連接的糖鏈結(jié)構(gòu)，但是，這種糖基化的程度會因為不同的生產(chǎn)細(xì)胞系而變化，并且可能取 決于用于生產(chǎn)單克隆抗體產(chǎn)品的培養(yǎng)條件。此外，CHO 細(xì)胞還可以在單克隆抗體上引入人抗體上 不存在的糖或者糖鏈，從而產(chǎn)生非活性或者具有免疫源性的產(chǎn)物。在單克隆抗體產(chǎn)品的其他天 冬酰胺殘基上也會發(fā)現(xiàn)類似的N-連接糖鏈。比如， 目前批準(zhǔn)的單克隆抗體產(chǎn)品，如西妥昔單抗 （Erbitux）約有15-20%的VH 區(qū)域的Asn88 上具有N-連接的糖基化。由于抗體糖基化是生產(chǎn)過 程中批間差異的主要原因，監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求全面表征單克隆抗體產(chǎn)品的糖基化性質(zhì)和程度。

單克隆抗體產(chǎn)品的完整糖基化表征包括分析分子中每一個潛在糖基化位點的百分比以及確 定不同的寡糖的結(jié)構(gòu)。如上所述，肽圖分析可以用于鑒定單克隆抗體產(chǎn)品中的糖基化位點以及位 點的占用比例。利用MS/MS 或者N 端測序分析對肽圖分析中釋放的肽段進(jìn)行分析，可以鑒定出產(chǎn) 物中每個糖基化位點的確切位置。每個位點的占有率則可以通過測定含有糖基化位點的肽段在有 或者沒有糖鏈的情況下的相對含量來確定。進(jìn)行此類分析時，需要注意確保糖鏈的存在不會對蛋白質(zhì)的消化降解產(chǎn)生影響。通過對釋放的每種肽段進(jìn)行測序，可以在某種程度上補(bǔ)償這種情況， 從而可以鑒定出切割位點的差異。

描述每一個糖基化位點的寡糖結(jié)構(gòu)可能會比較復(fù)雜，因為每個糖型結(jié)構(gòu)可能包含不同的含 量的唾液酸，可能存在雙觸角或者三觸角形式，也可能被巖藻糖化等。確定每種糖型的結(jié)構(gòu)首先 使用PNGaseF 從單克隆抗體上切割下完整的寡糖，然后通過HPLC 分離不同的寡糖結(jié)構(gòu)，使用一種 或者多種方法進(jìn)行測定。每個寡糖的結(jié)構(gòu)信息可以通過將樣品的洗脫時間與在相同色譜條件下同 時運行的一系列標(biāo)準(zhǔn)寡糖進(jìn)行比較來確定?；蛘呖梢酝ㄟ^質(zhì)譜法來確定寡糖的結(jié)構(gòu)，類似于單克 隆抗體產(chǎn)物的肽鏈上的氨基酸測序。將此方法確定的測序數(shù)據(jù)與先前確定的單糖組成數(shù)據(jù)相結(jié)合， 可以確保序列的準(zhǔn)確性。

 

4 亞可見顆粒的定量

單克隆抗體產(chǎn)品中存在的潛在顆粒的數(shù)量和大小對產(chǎn)品的一致性和安全性至關(guān)重要，尤其 是隨著FDA 越來越關(guān)注尺寸小于10um 的顆粒。在這個尺寸范圍內(nèi)，藥典上用于測量顆粒的方法 （USP <788>和EP 2.9.19）準(zhǔn)確性要稍差。盡管尚無監(jiān)管機(jī)構(gòu)期望控制此尺寸范圍的顆粒物，但是 已經(jīng)開始要求企業(yè)要確定此尺寸范圍內(nèi)的顆粒物的濃度并匯報結(jié)果。當(dāng)前藥典方法測定這些小顆 粒時的不準(zhǔn)確性，還需要在測定中應(yīng)用其他的分析方法。新方法可包括圖像分析、激光衍射和 偏振強(qiáng)度衍射分析（PID）。圖像分析可以捕獲懸浮在溶液中的顆粒經(jīng)過感應(yīng)區(qū)域時的圖像。圖像 分析軟件可以確定顆粒的濃度和大小。激光衍射分析基于與MALLS 相同的原理。入射光的微分散 射是溶液中顆粒大小的函數(shù)。偏振強(qiáng)度衍射也是使用光的微分衍射作為顆粒大小的函數(shù)關(guān)系來分 析，但是入射光在垂直和水平兩個方向上偏振，并且在多個波長下測定散射光以增加所獲得信息。目前，這些方法都不適合在QC 實驗室中實施，但是每種方法都可以提供有關(guān)單克隆抗體產(chǎn)品中存 在的亞可見（≤10um）的微粒的大小和濃度的信息。