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日前，國(guó)家衛(wèi)健委食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)審評(píng)委員會(huì)秘書處發(fā)布關(guān)于 28 項(xiàng)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和修改單（征求意見稿）意見的函（食標(biāo)秘發(fā)〔2025〕2號(hào)），其中包含了一項(xiàng)針對(duì)新的遺傳方法：大鼠體內(nèi)外周血紅細(xì)胞 Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的征求意見稿。

01背景信息

化學(xué)致突變物（chemical mutagens）是指能夠引起遺傳物質(zhì)（如 DNA 或者染色體）發(fā)生永久性變化的化學(xué)物質(zhì)。致突變作用可能導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，進(jìn)而引發(fā)多種健康問題，包括癌癥、基因相關(guān)疾病和遺傳性疾病等。

由于致突變物對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，其風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估已成為公共衛(wèi)生和產(chǎn)品安全領(lǐng)域的重要內(nèi)容。

遺傳毒性（genotoxicity）檢測(cè)則是識(shí)別和評(píng)估致突變性的重要手段。通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，可以有效篩查化學(xué)品、藥品、農(nóng)藥、食品添加劑、化妝品原料等產(chǎn)品中潛在的致突變風(fēng)險(xiǎn)。

因此，遺傳毒性評(píng)估在眾多行業(yè)都是產(chǎn)品上市前安全性評(píng)價(jià)的核心環(huán)節(jié)，比如廣泛應(yīng)用的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）。

02國(guó)內(nèi)外遺傳毒性測(cè)試方法

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，遺傳毒性測(cè)試方法不斷發(fā)展和完善。目前，國(guó)際上已建立了多種基于不同原理的試驗(yàn)方法。

各國(guó)和國(guó)際組織針對(duì)不同產(chǎn)品類型，制定了相應(yīng)的遺傳毒性評(píng)估“試驗(yàn)組合”（test battery）要求。通常的指導(dǎo)原則均要求盡量按照包括多個(gè)遺傳毒性機(jī)制，比如涵蓋不同生物類型（原核生物、真核生物）、體內(nèi)外環(huán)境、體細(xì)胞與生殖細(xì)胞等多個(gè)維度設(shè)置試驗(yàn)組合，盡可能全面地預(yù)測(cè)受試物的致突變性。

例如歐洲化學(xué)品管理局（ECHA）、國(guó)際人用藥物注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）、美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）、中國(guó)生態(tài)環(huán)境部、中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局等均對(duì)化學(xué)物質(zhì)的遺傳毒性測(cè)試提出了具體的試驗(yàn)項(xiàng)目和組合方案，以確保評(píng)估的科學(xué)性和全面性。

03Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)的發(fā)展歷程

Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)的發(fā)展，主要源于藥品行業(yè)對(duì)藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)新方法的需求。2011年，人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）建議，在條件允許時(shí)將多終點(diǎn)遺傳毒性研究整合至一般毒性研究中。

基于此，早在 2012 年，中國(guó)藥品研究機(jī)構(gòu)與安全評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)便開始關(guān)注 Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)的進(jìn)展。中國(guó)食品藥品檢定研究院及其他藥物安全評(píng)價(jià)研究機(jī)構(gòu)也開展了多項(xiàng)基礎(chǔ)研究，如歷史背景數(shù)據(jù)采集及多種受試物驗(yàn)證工作。

2017 年，ICHM7 文件將該試驗(yàn)列為細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)在非 S9 代謝活化條件下呈陽性時(shí)的追蹤試驗(yàn)。

相應(yīng)地，2022 年 6 月，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）正式將 Pig-a 基因突變方法納入，測(cè)試方法名稱為《Test Guideline No. 470 Mammalian Erythrocyte Pig-a Gene Mutation Assay》。

而此次征求意見稿的發(fā)布，是中國(guó)首次將該方法正式轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法。

04Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)原理

Pig-a 試驗(yàn)是一種基于磷脂酰肌醇N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶 A 類基因（Pig-a基因）突變檢測(cè)的遺傳毒性評(píng)價(jià)方法。

Pig-a 基因編碼N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶的催化亞基，該亞基在糖磷脂酰肌醇（GPI）錨的生物合成中起關(guān)鍵作用，并且其結(jié)構(gòu)和功能在不同物種間高度保守。

由于 Pig-a 基因片段中只需發(fā)生單一突變，即可導(dǎo)致細(xì)胞膜表面 GPI 錨鏈蛋白的缺失，因此，通過檢測(cè)細(xì)胞膜上 GPI 錨鏈蛋白的表達(dá)水平，可以靈敏地反映 Pig-a 基因是否發(fā)生了突變，從而用于評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的致突變性。

本次發(fā)布的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿，主要用于檢測(cè)受試物引起的紅系前體細(xì)胞 Pig-a 基因突變情況。

紅系前體細(xì)胞主要位于骨髓，其發(fā)生突變可表現(xiàn)為外周血成熟紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞突變水平增高。Pig-a 基因的任一突變即可能造成基因產(chǎn)物失活，導(dǎo)致細(xì)胞表面 GPI 錨定蛋白缺失，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞特定表面蛋白缺失（如CD59），表現(xiàn)為無法與熒光染料標(biāo)記的抗體相結(jié)合，因此可由流式細(xì)胞儀檢測(cè)區(qū)分。

試驗(yàn)原理圖，引自The in vivo Pig-a assay: A report of the International Workshop On Genotoxicity Testing (IWGT) Workgroup, Mutation Research 783 (2015)23-35

05Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)優(yōu)勢(shì)

01. 符合動(dòng)物福利要求

流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)只需要少量血量，對(duì)動(dòng)物只是微創(chuàng)，符合動(dòng)物福利的要求；

02. 樣本收集靈活

有較長(zhǎng)的檢測(cè)窗，允許試驗(yàn)過程中重復(fù)收集樣本檢測(cè)同一動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)的突變率，實(shí)現(xiàn)連續(xù)、動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)，采取重復(fù)給藥可以檢測(cè)體內(nèi)蓄積的致突變作用；

03. 可聯(lián)合其他毒理學(xué)試驗(yàn)

與其他毒理學(xué)試驗(yàn)整合的潛力高，比如可以整合至重復(fù)劑量毒性試驗(yàn)（比如 28 天大鼠毒性試驗(yàn)）中，也可聯(lián)合其他遺傳毒性試驗(yàn)終點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，如彗星試驗(yàn)、微核試驗(yàn)等。

2023 年，四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院就發(fā)表過體內(nèi)多終點(diǎn)遺傳毒性綜合評(píng)價(jià)體系的論文，整合大鼠體內(nèi) Pig-a 基因突變?cè)囼?yàn)、流式微核試驗(yàn)、彗星試驗(yàn)建立了體內(nèi)多終點(diǎn)（基因突變、染色體畸變和 DNA 損傷）遺傳毒性綜合評(píng)價(jià)體系；

04. 檢測(cè)成本低

可以在普通的動(dòng)物品系中進(jìn)行，相對(duì)于使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測(cè)方法（比如轉(zhuǎn)基因小鼠基因突變?cè)囼?yàn)以及 Hprt 基因突變?cè)囼?yàn)）成本更低。

綜合以上，該試驗(yàn)方法可以減少動(dòng)物的使用，符合“3R”的原則。

參考文獻(xiàn)

[1] OECD (2022), Test No. 470: Mammalian Erythrocyte Pig-a Gene Mutation Assay, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/4faea90e-en.

[2]周長(zhǎng)慧,張銘,王征,等.體內(nèi)Pig-a基因突變?cè)囼?yàn)國(guó)際聯(lián)合驗(yàn)證研究進(jìn)展[C]第二屆中國(guó)