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導(dǎo)讀

單克隆抗體（Monoclonal antibodys，mAbs）是一種約150千道爾頓的可溶性糖蛋白，由兩條相同的重鏈和輕鏈組成，通過(guò)二硫鍵連接形成四聚體結(jié)構(gòu)，包含兩個(gè)抗原結(jié)合片段（Fab）和一個(gè)Fc結(jié)構(gòu)域（圖1）。近年來(lái)，治療性mAbs及其衍生物在癌癥和自身免疫疾病等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

大多數(shù)治療性mAbs在哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如CHO細(xì)胞）中生產(chǎn)，但部分抗體片段已在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)。盡管大腸桿菌缺乏糖基化等翻譯后修飾，但生產(chǎn)的無(wú)糖基化抗體除了Fc片段介導(dǎo)的免疫效應(yīng)功能，其在生物、物理特性和體內(nèi)穩(wěn)定性上與糖基化抗體相似。因此，對(duì)于不依賴免疫效應(yīng)的抗體，無(wú)糖基化形式可成為標(biāo)準(zhǔn)。此外，經(jīng)過(guò)Fc片段工程化處理后，抗體仍可激活免疫效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)新的作用機(jī)制[1]。

圖1全長(zhǎng)糖基化單克隆IgG1抗體的晶體結(jié)構(gòu)[2]

一、大腸桿菌中的重組抗體的生產(chǎn)

大腸桿菌自上世紀(jì)80年代以來(lái)成為重組蛋白生產(chǎn)的理想宿主，至今已有超過(guò)85種藥物通過(guò)大腸桿菌生產(chǎn)。與其他宿主相比，大腸桿菌具備生長(zhǎng)快速、成本低、操作簡(jiǎn)便、生產(chǎn)率高等優(yōu)勢(shì)。此外，大腸桿菌能夠在細(xì)胞質(zhì)、周質(zhì)或培養(yǎng)基中表達(dá)重組蛋白，提供更大的生產(chǎn)靈活性（圖2）。目前，已有七種獲得批準(zhǔn)的抗體片段或衍生物在大腸桿菌的不同區(qū)域中生產(chǎn)（表1）[2]。

表1 已獲批大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)的單克隆抗體片段以及片段融合蛋白

圖2 大腸桿菌特有的抗體表達(dá)區(qū)室選擇

1.1大腸桿菌周質(zhì)生產(chǎn)FL-IgG及抗體

1984年，研究人員發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌還原性細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)全長(zhǎng)免疫球蛋白（Full-length immunoglobulin G，F(xiàn)L-IgG）時(shí)，形成包涵體，隨后通過(guò)溶解和復(fù)性進(jìn)行處理，但僅觀察到極少的抗原結(jié)合活性，隨后，研究重心從還原性細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)向氧化性周質(zhì)空間。2002年，Simmons等首次報(bào)道在周質(zhì)中表達(dá)功能性FL-IgG（圖3a）。通過(guò)優(yōu)化周質(zhì)中重鏈和輕鏈的表達(dá)與分泌平衡，并使用特定啟動(dòng)子和信號(hào)序列，成功在10 L發(fā)酵罐表達(dá)了幾種FL-IgG。隨后，Reilly和Yansura通過(guò)過(guò)表達(dá)氧化和異構(gòu)化伴侶蛋白DsbA和DsbC，使IgG1在高密度發(fā)酵中實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量。此外，Genentech公司利用Knobs-into-Holes（KiH）技術(shù)，在大腸桿菌周質(zhì)中開(kāi)發(fā)了雙特異性抗體表達(dá)系統(tǒng)（圖3b），成功生產(chǎn)多種抗體，包括靶向IL-4和IL-13的IgG4雙特異性抗體（Bispecific antibodys，BsAbs），應(yīng)用于哮喘治療。該公司還通過(guò)共培養(yǎng)方法生產(chǎn)了27種不同的BsAbs，并報(bào)告了成功生產(chǎn)抗CD3 BsAbs。

圖3 大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)無(wú)糖基化單克隆抗體

（a）和雙特異性抗體（b）示意圖

1.2大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)生產(chǎn)FL-IgG

盡管大腸桿菌周質(zhì)空間已被廣泛應(yīng)用生產(chǎn)FL-IgG，但由于其體積較小和轉(zhuǎn)運(yùn)瓶頸，大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)成為FL-IgG生產(chǎn)的另一個(gè)選擇。1984年，Genentech和Celltech分別在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中首次報(bào)道了FL-IgG和FL-IgM抗體的表達(dá)。但是由于細(xì)胞質(zhì)環(huán)境過(guò)于還原，抗體通常積累在包涵體中，需通過(guò)復(fù)性處理恢復(fù)抗原結(jié)合活性。

1.3大腸桿菌半氧化細(xì)胞質(zhì)生產(chǎn)FL-IgG

細(xì)胞質(zhì)中過(guò)于還原的環(huán)境阻礙了二硫鍵的正確配對(duì)，影響了FL-IgG的功能表達(dá)。為克服這一問(wèn)題，研究人員通過(guò)改造大腸桿菌菌株，創(chuàng)造了一個(gè)更具氧化性的細(xì)胞質(zhì)環(huán)境，成功表達(dá)了包括FL-IgG在內(nèi)的二硫鍵蛋白。

大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中存在兩條還原途徑——硫氧還原蛋白和谷胱甘肽還原蛋白途徑，它們會(huì)還原二硫鍵，通過(guò)刪除相應(yīng)還原酶基因gor和trxB來(lái)去除這兩條還原途徑，并通過(guò)突變過(guò)氧化物酶基因ahpC，研究者開(kāi)發(fā)出能夠支持二硫鍵形成的SHuffle®菌株。該菌株可以在細(xì)胞質(zhì)中成功生產(chǎn)多種可溶性且功能性強(qiáng)的FL-IgGs。2015年，Robinson等人首次報(bào)告了在SHuffle®菌株中成功生產(chǎn)具有正確二硫鍵結(jié)構(gòu)的抗HER2和抗VEGF抗體。

1.4在CFPS中生產(chǎn)FL-IgG和BsAbs

除傳統(tǒng)的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)外，F(xiàn)L-IgG也可以在無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)（Cell-free protein synthesis，CFPS）中生產(chǎn)。2008年，首次有報(bào)道展示了在大腸桿菌無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中生產(chǎn)活性抗體。Sutro Biopharma進(jìn)一步優(yōu)化了CFPS方法，通過(guò)調(diào)整重鏈和輕鏈基因的翻譯起始區(qū)，并添加伴侶蛋白DsbC和FkpA，成功實(shí)現(xiàn)了1 g/L的IgG產(chǎn)量。此外，該公司還通過(guò)CFPS成功生產(chǎn)了帶有KiH突變的BsAbs，并將DsbC和FkpA基因整合到其CFPS提取物來(lái)源菌株的染色體中，開(kāi)發(fā)了一種基于連續(xù)發(fā)酵的細(xì)胞提取物制備方法，用于生產(chǎn)抗體藥物偶聯(lián)物（Antibody-Drug Conjugates，ADCs）

二、抗體的表征和質(zhì)量控制

2.1生化表征

生化表征是抗體質(zhì)量控制的基礎(chǔ)，通過(guò)高效液相色譜、質(zhì)譜分析、SDS-PAGE電泳等方法分析抗體的分子結(jié)構(gòu)、氨基酸序列、糖基化修飾和分子量等，并測(cè)定抗體的抗原結(jié)合能力、親和力和特異性。

首個(gè)經(jīng)過(guò)生化特征徹底表征的大腸桿菌生產(chǎn)的FL-IgG是由Genentech在大腸桿菌的周質(zhì)中生產(chǎn)的抗TF抗體，表征表明其抗原結(jié)合活性與哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的同類抗體在抗原結(jié)合活性上相同。2008年，首次報(bào)道了大腸桿菌CFPS系統(tǒng)生產(chǎn)的抗肌酸激酶抗體的表征，與在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中生產(chǎn)的同類抗體在親和力上幾乎沒(méi)有差異。

總之，許多mAbs、BsAbs和ADCs已經(jīng)成功地從大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)，或從體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)（如CFPS和PURE系統(tǒng)）中生產(chǎn)、純化并表征，表明大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在表征上取得了重要進(jìn)展[3]。

2.2生物物理表征

生物物理表征包括評(píng)估其均一性、溶解性和聚集傾向?？贵w的穩(wěn)定性可通過(guò)對(duì)溫度、儲(chǔ)存條件、pH值、鹽濃度等因素的評(píng)估來(lái)測(cè)試。通常大腸桿菌生產(chǎn)的去糖基化抗體認(rèn)為具有穩(wěn)定性較差的特性，但研究表明其穩(wěn)定性與糖基化抗體相似。2002年Genentech公司報(bào)告，在大腸桿菌周質(zhì)中生產(chǎn)的抗TF抗體與CHO細(xì)胞生產(chǎn)的抗體具有相似的四級(jí)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。2008年，CFPS系統(tǒng)生產(chǎn)的抗MAK33抗體與CHO細(xì)胞生產(chǎn)的同類抗體展現(xiàn)出相似的熱穩(wěn)定性。盡管生物物理表征研究有所局限，但已顯示大腸桿菌生產(chǎn)的去糖基化抗體在所測(cè)試的條件下展現(xiàn)出與哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的糖基化抗體相似的穩(wěn)定性特征。

2.3生物學(xué)表征

生物學(xué)表征用于評(píng)估抗體的生物活性，包括細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞溶解（Complement dependent cytotoxicity，CDC）等,這些方法可以驗(yàn)證抗體的免疫學(xué)效應(yīng)，確認(rèn)其是否能夠有效結(jié)合靶標(biāo)，并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。IgG類藥物的治療效果來(lái)源于兩種機(jī)制：首先，通過(guò)Fab區(qū)域與靶抗原結(jié)合；其次，通過(guò)Fc域介導(dǎo)免疫反應(yīng)，發(fā)起抗病原體或癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)。分析結(jié)果表明去糖基化抗體在這些機(jī)制上與糖基化抗體相似。

2.4大腸桿菌產(chǎn)生的IgG的效應(yīng)功能

早期的研究表明，由于大腸桿菌產(chǎn)物缺乏糖基化修飾，所生產(chǎn)的抗體分子無(wú)法與Fc?RI、Fc?RIIIa和C1q結(jié)合，因此缺乏ADCC、CDC活性。隨后，經(jīng)進(jìn)一步研究顯示，大腸桿菌生產(chǎn)的無(wú)糖基化曲妥珠單抗（trastuzumab）與Fc?R1結(jié)合的親和力降低，導(dǎo)致ADCC、CDC功能完全喪失。盡管如此，這些無(wú)糖基化抗體仍能在其他方面保持治療效能。

2.5大腸桿菌產(chǎn)生的 IgG 的藥代動(dòng)力學(xué)特性

研究表明，缺乏N-糖基化的IgG能夠維持較長(zhǎng)的血清半衰期，這主要?dú)w因于其與FcRn受體的pH依賴性結(jié)合。因此，大腸桿菌生產(chǎn)的無(wú)糖基化IgG可能在缺乏Fc效應(yīng)功能的情況下，仍能維持較長(zhǎng)的血清半衰期。

例如，比較大腸桿菌來(lái)源的抗TF IgG1抗體與CHO細(xì)胞來(lái)源的IgG2和IgG4抗體在黑猩猩中的藥代動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示它們的半衰期相似。此外，大腸桿菌生產(chǎn)的無(wú)糖基化抗體與CHO細(xì)胞生產(chǎn)的糖基化抗體在獼猴中的藥代動(dòng)力學(xué)特性也相似。Genentech公司還研究了至少六種通過(guò)其KiH技術(shù)在大腸桿菌中生產(chǎn)的BsAbs的藥代動(dòng)力學(xué)特性。研究發(fā)現(xiàn)，在所測(cè)試的動(dòng)物模型中，大腸桿菌生產(chǎn)的無(wú)糖基化抗體的藥代動(dòng)力學(xué)特性與其哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的糖基化同類抗體相似。

三、抗體效應(yīng)功能（Fc片段）工程

大腸桿菌生產(chǎn)的去糖基化抗體因缺少N糖鏈，無(wú)法有效結(jié)合Fc?Rs或C1q，從而喪失ADCC和CDC等免疫效應(yīng)。通過(guò)工程化改造Fc結(jié)構(gòu)域，可以恢復(fù)或增強(qiáng)這些功能（表2）。例如，Jung等人通過(guò)展示Fc突變體文庫(kù)，篩選出能夠選擇性結(jié)合Fc?RI并誘導(dǎo)HER2過(guò)表達(dá)腫瘤細(xì)胞強(qiáng)烈ADCC的突變體（Fc5）。其他研究也通過(guò)優(yōu)化Fc結(jié)構(gòu)域，提高了與不同F(xiàn)c?Rs和C1q的結(jié)合選擇性，從而增強(qiáng)了ADCC效應(yīng)功能[4]。

此外，設(shè)計(jì)去糖基化抗體與Fc?RIIIa結(jié)合，可以顯著增強(qiáng)免疫效應(yīng)，尤其是在與巨噬細(xì)胞結(jié)合時(shí)，能夠觸發(fā)強(qiáng)烈的抗體依賴性細(xì)胞吞噬活性。這些工程化抗體不僅在體外表現(xiàn)出顯著生物效應(yīng)，還在體內(nèi)展現(xiàn)了良好的免疫活性和治療潛力?？傮w來(lái)說(shuō)，F(xiàn)c工程化為恢復(fù)去糖基化抗體的免疫效應(yīng)提供了有效方案，提升了其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用前景。

表2 大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)的抗體Fc結(jié)構(gòu)域工程化

結(jié)語(yǔ)

在過(guò)去十年中，mAbs的生產(chǎn)在大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)區(qū)室及無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中取得了重要進(jìn)展，顯著提高了抗體的滴度和質(zhì)量，降低了制造成本。這些進(jìn)展使得大腸桿菌生產(chǎn)的無(wú)糖基化抗體在過(guò)敏、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的臨床應(yīng)用具有更大潛力。雖然無(wú)糖基化抗體缺乏ADCC、CDC等Fc介導(dǎo)的效應(yīng)功能，但通過(guò)工程設(shè)計(jì)，一些無(wú)糖基化抗體展現(xiàn)出增強(qiáng)的效應(yīng)功能，甚至發(fā)現(xiàn)了新的效應(yīng)子功能?？偠灾竽c桿菌生產(chǎn)的無(wú)糖基化抗體具有與哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的糖基化抗體相當(dāng)?shù)闹委煗摿?。預(yù)計(jì)未來(lái)將有更多基于大腸桿菌生產(chǎn)的無(wú)糖基化抗體分子進(jìn)入臨床研究。