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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-06-12 20:50
摘 要： 建立高效液相色譜法測定FKP酶催化L-巖藻糖生成的GDP-L-巖藻糖。采用Agilent C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色譜柱，以2.72 g/L磷酸二氫鉀（含0.2% 四丁基溴化銨，磷酸調(diào)pH值為 4.0）和乙腈為流動相，流量為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，進樣體積為20 μL，柱溫為30 ℃，用二極管陣列檢測器測定。GDP-L-巖藻糖峰單一，無其它雜峰干擾。GDP-L-巖藻糖、二磷酸腺苷的質(zhì)量濃度分別在1.005～21.100、0.05～0.2 μg/mL 范圍內(nèi)與各自色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，檢出限分別為0.016、0.3 μg/mL。樣品加標平均回收率為99.6%，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.04%（n=6）。該方法適用于FKP酶催化L-巖藻糖生成的GDP-L-巖藻糖的測定。
關(guān)鍵詞： 高效液相色譜； 二極管陣列； GDP-L-巖藻糖； 酶催化
GDP-L-巖藻糖是L-巖藻糖的活性核糖形式，廣泛存在于生物中的糖基供體和代謝中間體中，是用于合成聚焦化的化合物 ［1-2］。GDP-L-巖藻糖廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品等領(lǐng)域，具有巨大的市場開發(fā)潛力［3］。GDP-L-巖藻糖合成過程中主要材料腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）由腺嘌呤核苷酸和3個磷酸基團組成。三磷酸鳥苷（GTP）結(jié)構(gòu)與ATP結(jié)構(gòu)類似，在磷酸基團上多了一個鳥嘌呤。在FKP酶的催化作用下，ATP為磷酸化游離的L-巖藻糖提供磷酸基團和能量，生成L-巖藻糖-1-磷酸（Fuc-1-P），同時ATP轉(zhuǎn)化為5'-腺苷二磷酸二鈉鹽（ADP）；隨后，在FKP蛋白的催化下，F(xiàn)uc-1-P與GTP反應(yīng)合成GDP-L-巖藻糖，且該步反應(yīng)可逆［4-5］。GDP-L-巖藻糖的合成路線見圖1。
圖1 GDP-L-巖藻糖的合成路線
Fig. 1 Synthesis route of GDP-L-fucose
目前，糖類化合物常用的檢測方法有氣相色譜法［6-7］、氣相色譜-質(zhì)譜法［8-9］、液相色譜-質(zhì)譜法［10-11］和液相色譜法［12-13］。GDP-L-巖藻糖作為重要的糖類化合物，文獻報道過的檢測方法主要有液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜分析法，王鴻超等［14］同時采用液相色譜法與質(zhì)譜分析法對發(fā)酵產(chǎn)生GDP-L-巖藻糖檢測，需要配置較高的離子交換柱。WANG等［15］采用薄層色譜法對GDP-L-巖藻糖粗反應(yīng)混合物進行了分析，需要配制繁瑣的展開劑和顯色劑，且色譜峰拖尾嚴重。GDP-L-巖藻糖的極性非常大，不易揮發(fā)，用氣相色譜檢測前處理需要衍生化，操作繁瑣。薄層色譜法是正相色譜法，對糖類化合物的分離度低，對極性大的物質(zhì)難以準確定性和定量，實驗室環(huán)境、操作者水平對實驗結(jié)果影響較大。液相色譜-質(zhì)譜法具有高靈敏度和高選擇性，但其分析的樣品需要進行純化，不能實時監(jiān)控反應(yīng)情況。
筆者采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）測定FKP酶催化L-巖藻糖生成的GDP-L-巖藻糖，不僅可以進行全波長掃描，而且還能提供定性、定量和光譜信息［16-17］，能夠?qū)崟r監(jiān)控實驗反應(yīng)情況，滿足簡便、快捷的實際需要，為FKP酶活性驗證和GDP-L-巖藻糖的合成研究提供進一步的技術(shù)參考。
1 實驗部分
1.1 主要儀器與試劑
高效液相色譜儀：Ultimate 3000型，配二極管陣列檢測器，美國賽默飛世爾科技公司。電子天平：BT125D型，感量0.01 mg，德國賽多利斯公司。高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Maxis Ultimate 300型，德國布魯克公司。真空冷凍干燥機：LGJ-20V型，北京四環(huán)起航科技有限公司。高速冷凍離心機：Fresco 21型，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZHWY-100H型，上海智城分析儀器制造有限公司。二氯化錳、磷酸二氫鉀：均為分析純，西隴科學股份有限公司。四丁基溴化銨、Tris鹽：均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。磷酸：純度（質(zhì)量分數(shù)）不小于85.0 %，天津市富宇精細化工有限公司。乙腈、甲醇：均為色譜純，德國默克公司。ADP、ATP、GTP、L-巖藻糖對照品：批號分別為A861411、A822580、C10835995、L809666，上海麥克林生化科技有限公司。GDP-L-巖藻糖對照品：批號為RM0222512，西安齊岳生物科技有限公司。FKP酶：自制，經(jīng)過陜西師范大學課題組實驗認證，并通過SDS-PAGE測定。實驗用水：超純水。
1.2 色譜條件
色譜柱：Agilent C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm，美國賽默飛世爾科技公司）；檢測器：二極管陣列檢測器；流動相：A相為2.72 g/L磷酸二氫鉀溶液（含有0.2 %四丁基溴化銨，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0），B相為乙腈，流量為.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣體積：20 μL；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序Tab. 1 Gradient elution procedure
| 時間/min | 體積分數(shù)/% | |
| 流動相A11 | 流動相B22 | |
| 0 ~ 5 | 90 | 10 |
| 5 ~ 25 | 90 → 65 | 10 → 35 |
| 25 ~ 28 | 65 → 90 | 35 → 10 |
| 28 ~ 30 | 90 | 10 |
注：1）2.72 g/L磷酸二氫鉀溶液（含有0.2 %四丁基溴化銨，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）；2）乙腈。
1.3 GDP-L-巖藻糖的合成
320 μL反應(yīng)體系包含Mn2+（1.95 mg/mL）、 ATP（1.875 mg/mL）、GTP（1.875 mg/mL）、Tris-HCI緩沖液（7.5 mg/mL，pH值為7.5）、L-巖藻糖（25.625 mg/mL）和質(zhì)量濃度為9.06 mg/mL的FKP酶，將其放入37 ℃ 恒溫培養(yǎng)振蕩器中，以225 r/min速率震蕩反應(yīng)12 h，ATP與GTP完全反應(yīng)后，于100 ℃煮沸10 min，終止酶反應(yīng)，即可得到GDP-L-巖藻糖。
1.4 溶液配制
GDP-L-巖藻糖對照品儲備液：12.66 mg/mL，精密稱取GDP-L-巖藻糖對照品63.30 mg，置于5 mL容量瓶中，用水溶解并定容至標線。ADP對照品儲備液：0.01 mg/mL，精密稱取ADP對照品0.05 mg，置于5 mL容量瓶中，用水溶解并定容至標線。ATP對照品儲備液：120.20 mg/mL，精密稱取ATP對照品0.6010 g，置于5 mL容量瓶中，用水溶解并定容至標線。GTP對照品儲備液：120.06 mg/mL，精密稱取GTP對照品0.600 3 g，置于5 mL容量瓶中，用水溶解并定容至標線。GDP-L-巖藻糖系列標準工作溶液：分別精密量取GDP-L-巖藻糖對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2 μL，用移液槍將對照品溶液用水稀釋至約1 200倍體積，得GDP-L-巖藻糖質(zhì)量濃度分別為0.001 055、0.002 11、0.005 275、0.010 55、0.015 825、0.021 1 mg/mL的GDP-L-巖藻糖系列標準工作溶液。ADP系列標準工作溶液：精密量取ADP對照品溶液5、8、10、12、15、20 μL，用移液槍加水進行稀釋，得ADP的質(zhì)量濃度分別為 0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.20 μg/mL的ADP系列標準工作溶液。
1.5 樣品處理
取1.3合成的GDP-L-巖藻糖，于室溫下靜置5 min，然后以10 000 r/min離心2 min，取上層清液5 μL注入進樣小瓶，用移液槍將樣品用水稀釋至約1 000倍體積，用0.22 μm針頭過濾器過濾，取續(xù)濾液，得樣品溶液。
1.6 樣品測定
取樣品溶液、GDP-L-巖藻糖系列標準工作溶液和ADP系列標準工作溶液，按1.2色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積，建立GDP-L-巖藻糖和ADP的標準工作曲線，計算線性方程，利用標準曲線法計算樣品中GDP-L-巖藻糖的含量。
2 結(jié)果與討論
2.1 GDP-L-巖藻糖的合成
合成GDP-L-巖藻糖的酶催化反應(yīng)中，F(xiàn)KP酶在以L-巖藻糖、ATP和GTP為起始底物的反應(yīng)混合物中生產(chǎn)GDP-L-巖藻糖，在37 ℃條件下，未加FKP酶時有自發(fā)反應(yīng)生成少量GDP-L-巖藻糖，當反應(yīng)開始0.5 h，GDP-L-巖藻糖產(chǎn)量快速增加；當反應(yīng)2 h后，增速變緩；當12 h后ATP和GTP均反應(yīng)完成，GDP-L-巖藻糖質(zhì)量濃度達到最大值1.20 mg/mL。
2.2 GDP-L-巖藻糖定性
取純化后的GDP-L-巖藻糖，經(jīng)過二極管陣列檢測器全波長掃描和高分辨質(zhì)譜分析，全波長掃描結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，合成的GDP-L巖藻糖最大吸收為254.22 nm，GDP-L巖藻糖對照品最大紫外吸收波長為254.16 nm，兩者相符。
圖2 DAD 檢測器對 GDP-L-巖藻糖在200～400 nm波長范圍的吸光度掃描
Fig. 2 Absorbance Scanning of GDP-L-Fucose by DAD Detector in the Wavelength Range of 200-400 nm
C16H25N5NaO15P2（M-H+）的高分辨質(zhì)譜分析如圖3所示。從圖3中可以看出，在HR-MS（ESI-）C16H25N5NaO15P2（M-H+）下，離子的質(zhì)荷比實測值為588.078 5，與根據(jù)得到的質(zhì)荷比峰試驗數(shù)據(jù)計算值588.082 2，兩者相符。由此可見，得到的產(chǎn)物定性為GDP-L-巖藻糖。
圖3 C16H25 N5NaO15P2（M-H+）的高分辨質(zhì)譜（ESI-）分析圖
Fig. 3 HR-MS（ESI-） analysis diagram of C16H25 N5NaO15P2（M-H+）
2.3 色譜條件優(yōu)化
2.3.1 溶劑的選擇在室溫條件下，分別稱取ADP、ATP、GTP、L-巖藻糖、GDP-L-巖藻糖約0.1 mg，再分別溶于1 mL超純水、乙腈、甲醇、水-乙腈體系，觀察溶解情況，試驗結(jié)果見表2。由表2可知，5種物質(zhì)在超純水和初始流動相水-乙腈（體積比為90∶10）溶劑均能溶解。為了減弱溶劑效應(yīng)［18-19］對檢測結(jié)果的干擾，同時考慮到節(jié)約成本和環(huán)保，最終選取水作為溶劑。
表2 5種物質(zhì)在不同溶劑中溶解情況
Tab. 2 Solubility of 5 substances in different solvents
| 物質(zhì) | 溶解情況 | |||
| 水 | 甲醇 | 乙腈 | 水-乙腈（體積比90:10） | |
| ADP | 易溶 | 微溶 | 微溶 | 溶解 |
| ATP | 易溶 | 微溶 | 微溶 | 溶解 |
| GTP | 易溶 | 微溶 | 微溶 | 溶解 |
| L-巖藻糖 | 易溶 | 溶解 | 微溶 | 溶解 |
| GDP-L-巖藻糖 | 易溶 | 溶解 | 微溶 | 溶解 |
2.3.2 檢測波長的選擇用二極管陣列檢測器對ADP、ATP、GTP、L-巖藻糖、GDP-L-巖藻糖對照品溶液在200～400 nm波長范圍下進行掃描，各物質(zhì)紫外吸收光譜圖如圖4所示。從圖4中可以看出，ADP、ATP和GTP最大吸收波長分別為258.40、258.89、 254.57 nm，GDP-L-巖藻糖最大吸收波長為254.13 nm，L-巖藻糖在此波長范圍內(nèi)無紫外吸收，GTP、GDP-L-巖藻光譜有重疊，ADP與ATP光譜有重疊。
圖4 各物質(zhì)紫外吸收光譜
Fig. 4 UV absorption spectra of substances
通過二極管陣列檢測器光譜檢測，ADP、GDP-L-巖藻糖、ATP、GTP等吸收線如圖5所示。從圖5中可以看出，GDP-L-巖藻糖、ADP、ATP、GTP在254 nm基線平穩(wěn)，各組分的響應(yīng)高，均有較強的紫外吸收，故檢測波長為254 nm。
圖5 等吸收線圖
Fig. 5 Isoabsorption line diagram
1—ADP； 2—GDP-L-巖藻糖； 3—ATP； 4—GTP
2.3.3 流動相的選擇
分別考察乙腈和甲醇為有機相，結(jié)果表明，以甲醇為有機相時GDP-L-巖藻糖信號響應(yīng)差，色譜峰形較差，其它各組分色譜保留時間延長，以乙腈為有機相時GDP-L-巖藻糖色譜峰出峰時間前移，各組分色譜峰信號響應(yīng)上升，故選用洗脫能力強的乙腈作為有機相。
分別考察等度洗脫和梯度洗脫的方法，等度洗脫考察了乙腈-水相體積比分別為10∶90、50∶50時，GTP和GDP-L-巖藻糖峰均難以分開，故采用梯度流動相洗脫法。
采用1.2色譜條件，分別考察流動相中不同水相的組成：①A相：水（用磷酸調(diào)pH值為4.0），B相：乙腈；②A相：2.72 g/L磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調(diào)pH值為4.0），B相：乙腈；③ A相：0.2%四丁基溴化銨溶液（用磷酸調(diào)pH值為 4.0），B相：乙腈；④ A相：2.72 g/L磷酸二氫鉀緩沖液（含有0.1 %四丁基溴化銨，用磷酸調(diào)pH值為4.0），B相：乙腈；⑤A相：2.72 g/L磷酸二氫鉀緩沖液（含有0.2 %四丁基溴化銨，用磷酸調(diào)pH 值為4.0），B相：乙腈。不同流動相分離效果見表3。由表3可知，在流動性極性相似情況下，加入四丁基溴化銨的流動相體系梯度洗脫時各物質(zhì)分離效果優(yōu)于其他體系，這是由于ADP、ATP、GTP、GDP-L-巖藻糖4種物質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有磷酸基團和大量羥基基團，加入四丁基溴化銨可以與色譜柱固定相發(fā)生作用而吸附在固定床上，使固定相具有一定離子交換能力，從而增強負電荷分析物的保留，但是必須與磷酸二氫鉀配合使用，增加流動相的緩沖能力，提高各物質(zhì)的分離度。用磷酸調(diào)節(jié)為酸性環(huán)境，可以有效抑制羥基水解，確保離子化程度，改善峰形。
表3 不同流動相分離效果
Tab. 3 Separation effect of different mobile phases
| 流動相體系編號 | 分離效果描述 |
| ① | 峰重疊 |
| ② | 峰重疊 |
| ③ | 峰重疊 |
| ④ | ADP與GDP-L-巖藻糖分離效果差 |
| ⑤ | 峰分離效果好，分離度大于1.5 |
注：①水（用磷酸調(diào)pH值為4.0）-乙腈；②2.72 g/L磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調(diào)pH值為4.0）-乙腈；③ 0.2%四丁基溴化銨溶液（用磷酸調(diào)pH值為 4.0）-乙腈；④ 2.72 g/L磷酸二氫鉀緩沖液（含0.1 %四丁基溴化銨，用磷酸調(diào)pH值為4.0）-乙腈；⑤2.72 g/L磷酸二氫鉀緩沖液（含0.2 %四丁基溴化銨，用磷酸調(diào)pH 值為4.0）-乙腈。
2.3.4 色譜柱、柱溫、pH值、流量的選擇
ADP、ATP、GTP、GDP-L-巖藻糖均屬于極性化合物，相對分子質(zhì)量均小于1 000，C18鍵合相可以最大限度地保留極性化合物，烷基柱更適用于極性大的樣品，因此選擇十八烷基硅烷鍵合硅膠柱作為實驗所用色譜柱。根據(jù)色譜柱越長，分離度越好，適合極性化合物，因此選擇250 mm長柱。使用色譜柱為4.6 mm內(nèi)徑色譜柱，流量為1.0 mL/min可以使柱壓保持在合理范圍。
由于流動相中添加酸性離子對試劑，pH值和柱溫對各物質(zhì)分離影響較大，分別考察了色譜柱溫度（25、30、40、50 ℃）以及流動相pH值（4.0、3.5）條件下對色譜分離效果的影響，最終確定色譜柱溫度為30 ℃，流動相pH值為4.0，該條件下，各物質(zhì)的分離效果最佳。
2.4 方法學評價
2.4.1 專屬性按照1.2色譜條件測定空白溶液、GDP-L-巖藻糖對照品溶液和樣品溶液，疊加色譜圖結(jié)果如圖6所示。從圖6中可以看出，空白溶液無雜峰，GDP-L-巖藻糖出峰位置無干擾峰，樣品與對照品出峰時間一致，表明方法專屬性良好。
、
圖6 空白溶液、GDP-L-巖藻糖對照品溶液和樣品溶液色譜圖
Fig. 6 Chromatogram of blank solution， GDP-L-fucose reference solution， sample solution、
2.4.2 線性方程與檢出限
在1.2色譜條件下，分別測定GDP-L-巖藻糖系列標準工作溶液，試驗結(jié)果見表4。
表4 系列標準工作溶液測定結(jié)果
Tab. 4 Determination results of series standard working solutions
| 組分 | 質(zhì)量濃度 (μg·mL?¹) | 色譜峰面積 |
| GDP-L-巖藻糖 | 1.055 | 3.144 |
| 2.11 | 5.378 | |
| 5.275 | 11.527 | |
| 10.55 | 21.481 | |
| 12.66 | 25.775 | |
| 21.1 | 41.72 |
以化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標進行線性回歸，計算線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)。得到GDP-L-巖藻糖線性方程為y=1 920.9x+1.282 8，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9，表明GDP-L-巖藻糖的質(zhì)量濃度在1.005～21.100 μg/mL 范圍內(nèi)與各自色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。對GDP-L-巖藻糖對照品溶液進行稀釋，按照檢出限/定量限=1∶3配制檢出限溶液[18-19]，得到GDP-L-巖藻糖方法檢出限為0.3 μg/mL。2.4.3 精密度試驗取1.3合成的GDP-L-巖藻糖，按照1.5樣品處理方法制備6份平行樣品溶液，在1.2色譜條件下測定，試驗結(jié)果見表5。
表5 精密度試驗結(jié)果
Tab. 5 Results of the precision test
| 組分 | 峰面積 | 質(zhì)量濃度/(mg·mL?¹) | RSD% | |
| 測定值 | 平均值 | |||
| GDP-L-巖藻糖 | 12.804 | 1.99 | 0.04 | |
| 12.813 | 1.2 | |||
| 12.808 | 1.2 | 1.2 | ||
| 12.802 | 1.2 | |||
| 12.81 | 1.2 | |||
| 12.802 | 1.99 | |||
由表5可知，GDP-L-巖藻糖平均含量（質(zhì)量濃度）為1.20 mg/mL，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.04%，說明該方法的精密度良好。2.4.4 樣品加標回收試驗取離心管的反應(yīng)液上清液作為GDP-L-巖藻糖樣品，按照1.5樣品處理方法制備樣品溶液9份，分別加入適量GDP-L-巖藻糖對照品溶液，采用1.2色譜條件下進行測定，試驗結(jié)果見表6。由表6可知，GDP-L-巖藻糖的加標平均回收率為99.6%，表明該方法準確度良好。
表6 加標回收試驗結(jié)果
Tab. 6 Results of recoveries test
| GDP-L-巖藻糖質(zhì)量ug | 回收率/% | 平均回收率/% | ||
| 本底值/μg | 加標量/μg | 測定值/μg | ||
| 5.53 | 4.3 | 9.82 | 99.8 | 99.6 |
| 5.61 | 4.3 | 9.74 | 96 | |
| 5.64 | - | 9.67 | 93.7 | |
| 5.39 | 5.38 | 11.09 | 105.9 | |
| 5.32 | 5.38 | 10.64 | 98.9 | |
| 5.22 | - | 10.66 | 101.1 | |
| 5.59 | - | 8.89 | 102.5 | |
| 5.47 | 3.22 | 8.73 | 101.2 | |
| 5.58 | - | 8.71 | 97.2 | |
3 結(jié)語
建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器對GDP-L-巖藻糖的酶催化反應(yīng)中GDP-L-巖藻糖的測定方法。該方法簡單、靈敏、準確，能夠提供光譜信息對GDP-L-巖藻糖的定性分析，實時監(jiān)控GDP-L-巖藻糖合成過程中的反應(yīng)情況，可為FKP酶催化反應(yīng)的機理研究和GDP-L-巖藻糖的量化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。
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來源：化學分析計量
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