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今天給小伙伴們分享的是PCR引物設(shè)計(jì)的8大原則，直接上干貨，設(shè)計(jì)引物的時候，我們都需要考慮哪些因素呢？

PCR引物設(shè)計(jì)的目的是確保PCR反應(yīng)能夠有效、特異性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)DNA序列。所以引物的好壞，直接關(guān)乎實(shí)驗(yàn)的成功。

1、引物長度：18-30nt，通常以20nt左右最為常用。上下游引物的長度最好基本相等，最多相差不超過3bp。引物過短，易導(dǎo)致非特異擴(kuò)增；較長的引物雖特異性好，但在引物內(nèi)易形成二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾環(huán)。

2、引物GC含量：40-60%，G+C比例太低擴(kuò)增效果不佳，G+C比例過高易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)重復(fù)的基序。

3、引物的熔解溫度：55-75℃，退火溫度需要比解鏈溫度低5℃。引物對之間的Tm的差異應(yīng)不超過2-3℃。

引物的熔解溫度（Tm）是指在特定條件下，DNA或RNA引物雙鏈解鏈成為單鏈的中點(diǎn)溫度。Tm值對于PCR反應(yīng)的退火步驟至關(guān)重要，因?yàn)樗绊懸锱c目標(biāo)DNA的結(jié)合效率。計(jì)算引物的Tm值可以使用以下基本公式

對于短于20個堿基的引物，可以使用以下簡化公式估算Tm：

其中，A表示腺嘌呤（A）的數(shù)量，T表示胸腺嘧啶（T）的數(shù)量，C表示胞嘧啶（C）的數(shù)量，G表示鳥嘌呤（G）的數(shù)量。

4、引物擴(kuò)增跨度：普通PCR以200-500bp為宜，實(shí)時熒光PCR則為70-150bp。

5、引物的二級結(jié)構(gòu)：引物設(shè)計(jì)最好跨內(nèi)含子設(shè)計(jì)，避免出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響。

6、確保堿基的隨機(jī)分布

引物設(shè)計(jì)中四種堿基的分步保持隨機(jī)性，有助于提高引物的合成效率和PCR擴(kuò)增的特異性，應(yīng)避免設(shè)計(jì)包含5個或更多連續(xù)相同堿基的引物，如AAAAAAAA或CCCCCCCC。同聚物串可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，并且可能在PCR過程中形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體。

7、確保引物自身/之間沒有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)

避免引物自身或引物之間出現(xiàn)連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)非常重要，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增或影響PCR的效率。單個引物不應(yīng)在其序列內(nèi)部形成互補(bǔ)，這會促使發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，從而降低可用于擴(kuò)增的引物濃度。一對引物（正向和反向）之間也不應(yīng)存在連續(xù)4個堿基以上的互補(bǔ)，以防止它們形成穩(wěn)定的二聚體。3'端穩(wěn)定性：特別要注意引物的3'端，因?yàn)镈NA聚合酶在3'端容易出錯，如果3'端存在互補(bǔ)序列，可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

8、引物5'端可修飾，3'不可修飾

5'端修飾的常見目的：

標(biāo)記與檢測：在5'端添加熒光標(biāo)記或其他標(biāo)簽，便于擴(kuò)增子的檢測和分析。

引入限制性酶切位點(diǎn)：為了將擴(kuò)增的片段克隆到特定的載體中，可以在5'端添加限制性酶切位點(diǎn)序列。

引入突變：在5'端設(shè)計(jì)引物時，可以引入特定的點(diǎn)突變，用于構(gòu)建突變體或進(jìn)行定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)。

增加引物的Tm：通過在5'端添加G或C堿基，可以提高引物的Tm值，有助于提高PCR的特異性。

提高引物的溶解度：有時在5'端添加一些非特異性的序列，可以提高引物在水中的溶解度。

3'端修飾的注意事項(xiàng)：

穩(wěn)定性：3'端的穩(wěn)定性對PCR擴(kuò)增至關(guān)重要，因?yàn)镈NA聚合酶在3'端添加核苷酸。如果在3'端引入修飾，可能會影響DNA聚合酶的延伸效率。

非特異性擴(kuò)增：3'端修飾可能增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險，因?yàn)樾揎椏赡芨淖円锱c模板DNA的配對方式。

錯配容忍度：DNA聚合酶對3'端的錯配容忍度較低，修飾可能會影響引物的特異性。

延伸效率：3'端的修飾可能影響DNA聚合酶的延伸效率，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。