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原理

PCR 反應(yīng)特異性擴增的一個關(guān)鍵條件是引物的正確設(shè)計，使用不合適的PCR 引物容易導(dǎo)致實驗失敗：表現(xiàn)為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。
 

用途

合理的引物設(shè)計有利于得到特異性的產(chǎn)物

步驟

一、引物設(shè)計原則

1.引物長度：PCR 的特異性通過引物長度和退火溫度控制，一般16-24 個堿基。

注：引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

2. G+C 含量：G+C 的含量一般控制在40-60% 左右。

注：GC 含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC 含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm 值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50% 寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm 值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T） 估計引物的Tm 值，則有效引物的Tm 為55~80℃，其Tm 值最好接近72℃ 以使復(fù)性條件最佳。

3.堿基隨機分布。為避免PCR 產(chǎn)物的突變，一般不建議3' 端連續(xù)相同的堿基，并且目的片段的某一序列連續(xù)多個相同堿基的位置，極容易出現(xiàn)突變。

注：引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是 3' 端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′ 端不應(yīng)超過3 個連續(xù)的G 或C，因這樣會使引物在GC 富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。

二、實驗步驟

1.目的片段的獲取

設(shè)計引物取決于待擴增的目的片段。在NCBI 首頁的搜索框的下拉菜單中選擇Gene，再在對話框中輸入目的基因的名稱；選擇對應(yīng)的來源之后，選擇對應(yīng)需要的亞型，將其編碼基因的CDS 區(qū)域保存。

2.引物的設(shè)計

引物設(shè)計方法很多。用Oligo7 軟件打開保存的序列，將光標(biāo)拉至擴增序列的最前端，點擊Edit，里面選擇Edit forward primer，系統(tǒng)默認(rèn)21 個堿基，按照A/undefined2+C/undefined4 計算引物的Tm 值，一般Tm 值在54-64 之間，可根據(jù)這個范圍調(diào)節(jié)引物的長度。調(diào)整完成之后將這段編輯后的序列按5'-3' 的方向復(fù)制到Excel 表格中，同樣的方法設(shè)計后引物并復(fù)制到Excel 表格。

3.引物的調(diào)整

按照質(zhì)粒構(gòu)建的方法，在前后引物的5' 端加上酶切序列（T4 連接酶的方法）或15-20 bp 的載體酶切位點附近的載體序列（同源重組的方法），按照載體上的酶切序列編碼情況，還需要在前引物ATG 起始前加入堿基以免編碼錯位，以及確認(rèn)后引物是否需要終止密碼子。

注意事項

1.注意正反向引物都是5'-3' 的方向；

2.注意前引物中可能存在錯碼的可能以及后引物的提前終止。

常見問題

一、PCR 沒有產(chǎn)物或二聚體太多

1.引物設(shè)計錯誤，特別是沒有注意后引物的方向；

2.調(diào)節(jié)PCR 時退火溫度

3.提高模板的質(zhì)量或模板的使用量；

4.設(shè)計新的引物。

二、構(gòu)建的質(zhì)粒不能編碼基因

1.沒有注意前引物的移碼突變問題；

2.沒有注意后引物終止密碼子的問題；

3.排除其他情況下，換載體。