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嘉峪檢測網(wǎng) 2025-06-19 20:40
摘 要： 建立谷芽飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑超高效液相特征圖譜方法，并測定其中7種成分的含量。以Inertsil ODS-3柱（150 mm×2.1 mm，2.0 μm）為色譜柱，以甲醇-水（用0.01%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5）為流動相進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為30 ℃，流量為0.2 mL/min，檢測波長為260 nm。谷芽飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜共確定了13個共有峰，確認(rèn)了7個共有峰成分，其中峰1為尿嘧啶、峰3為次黃嘌呤、峰5為尿苷、峰6為腺嘌呤、峰8為鳥苷、峰12為色氨酸、峰13為腺苷。借助中藥色譜指紋圖譜相似度系統(tǒng)評價相似度，15批樣品相似度在0.97以上。7種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.04~1.04 μg/mL，定量限為0.13~3.47 μg/mL。樣品加標(biāo)平均回收率為98.65%～100.13%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%～1.46%（n=9）。該方法可為谷芽飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制提供參考。
關(guān)鍵詞： 谷芽； 特征圖譜； 高效液相色譜法； 標(biāo)準(zhǔn)湯劑； 含量測定
粟廣泛分布于亞洲、美洲及非洲等地，我國是粟最大的栽種地［1］。粟含有豐富的營養(yǎng)成分如膳食纖維、淀粉、維生素及氨基酸等［2-3］，具有抗氧化、降血壓、降血糖及抗炎等作用［4-6］。谷芽是粟的成熟果實(shí)經(jīng)發(fā)芽干燥的炮制加工品，主要功效為消食和中、健脾開胃［7］。目前，關(guān)于谷芽的相關(guān)成分研究較少，主要集中于γ-氨基丁酸和其他物質(zhì)［8-10］。
中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，參照實(shí)際應(yīng)用基礎(chǔ)，通過現(xiàn)代方法對中藥進(jìn)行提取制備而成的［11］。通過對標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行研究分析，有利于把控成品質(zhì)量，可為后續(xù)藥品制備打下基礎(chǔ)。谷芽作為《中華人民共和國藥典》2020年版一部收錄藥材，藥典中并無規(guī)定特征圖譜項及含量測定項。相關(guān)中藥制品中，谷芽配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)中有規(guī)定尿苷及腺苷的含量。核苷類是生物細(xì)胞維持生命活動必不可少的物質(zhì)之一，其具有抗癌、抗病毒、抗氧化等作用［12-14］，有較好的水溶性。中藥經(jīng)水煎煮入藥，核苷類應(yīng)為其不可忽視的研究成分，從該角度出發(fā)，筆者開發(fā)了谷芽特征圖譜并測定了其中7種核苷類及氨基酸類的含量，通過對谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑的考察，達(dá)到后續(xù)相關(guān)制劑質(zhì)量控制的目的。
1 實(shí)驗部分
1.1 主要儀器與試劑
超高效液相色譜儀：Thermo Vanquish Flex UHPLC系統(tǒng)，配有四元溶劑管理器（VF-P20-A）、自動進(jìn)樣器（VF-A10-A-02）、色譜柱溫箱（VH-C10-A-02）、DAD檢測器（VF-D40-A），賽默飛世爾科技（中國）有限公司。
電子天平：（1）ME365型，感量為0.001 mg，德國賽多利斯儀器公司；（2）XSR304型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。
煎藥器：深圳一枚王有限公司。
冷凍干燥機(jī)：CTFD-18S型，青島永合創(chuàng)信電子科技有限公司。
超純水過濾系統(tǒng)：ULPHW-IV型，四川優(yōu)普超純科技有限公司。
尿嘧啶、尿苷對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為99.6%，批號分別為100469-201302、110887-202305，中國食品藥品檢定研究院。
次黃嘌呤、腺苷對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為99.4%，批號分別為140661-202005、110879-202204，中國食品藥品檢定研究院。
腺嘌呤、色氨酸對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為100.0%，批號分別為110886-202404、140686-202205，中國食品藥品檢定研究院。
鳥苷對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88.6%，批號為111977-202202，中國食品藥品檢定研究院。
甲醇：色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。
磷酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。
實(shí)驗用水為自制純化水。
谷芽飲片樣品：共15批（編號為Y1～Y15），經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)楊青山教授鑒定為禾本科植物粟的成熟果實(shí)經(jīng)發(fā)芽干燥的炮制加工品，即為谷芽。15批谷芽藥材產(chǎn)地信息見表1。
表1 15批谷芽產(chǎn)地來源信息
Tab. 1 Source information of 15 batches of millet sprouts
1.2 儀器工作條件
色譜柱：Inertsil ODS-3柱[150 mm×2.1 mm，2.0 μm，島津企業(yè)管理（中國）有限公司]；柱溫：30 ℃；流動相：A相為甲醇，B相為水（用0.01%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5）；進(jìn)樣體積：2 μL；檢測波長：260 nm；流量：0.2 mL/min；梯度洗脫程序見表2。
表2 梯度淋洗程序
Tab. 2 Gradient washing program
注：1）水需用0.01%磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5。
1.3 實(shí)驗步驟
1.3.1 溶液制備
谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉溶液：取谷芽飲片樣品200 g，遵循臨床湯劑煎煮方法，加水煎煮兩次，合并兩次煎液，煎液于65 ℃下減壓濃縮至相對密度為1.04～1.10 g/mL[（65±5） ℃]流膏，冷凍干燥，制成谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（編號為G1～G15）。取谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入20%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇25 mL，超聲（功率為250 W，頻率40 kHz） 30 min，放冷，補(bǔ)足質(zhì)量，取續(xù)濾液，即得。
混合對照品溶液：精密稱取尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、色氨酸、腺苷對照品適量，加20%甲醇溶液，制成質(zhì)量濃度分別為69.7、71.6、74.7、114.5、73.3、61.1、71.8 μg/mL。
空白樣品溶液：取20%甲醇溶液適量，即得。
1.3.2 實(shí)驗方法
分別取15批谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉溶液、混合對照品溶液、空白樣品溶液，在1.2儀器工作條件下測定。將15批樣品色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，對所得谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜圖進(jìn)行分析。根據(jù)混合對照品的保留時間及色譜峰面積，按照外標(biāo)法測定尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、色氨酸和腺苷的含量。
2 結(jié)果與討論
2.1 實(shí)驗條件的優(yōu)化
2.1.1 檢測波長的選擇
液相色譜采集時選擇3D全波長掃描，尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、色氨酸、腺苷分別在259、249、261、260、253、218、260 nm有最大吸收。分別在220、260、300 nm處觀察色譜圖。當(dāng)在220 nm處基線波動較大，各峰響應(yīng)值均不高；當(dāng)在300 nm處僅觀察到少數(shù)色譜峰；當(dāng)在260 nm處多數(shù)成分有最大吸收，同時色氨酸色譜峰響應(yīng)值也適中，因此選擇谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑檢測波長為260 nm。
2.1.2 流動相的選擇
結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)［15-17］，對谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜梯度條件進(jìn)行考察時發(fā)現(xiàn)，核苷類成分在高水相下更易洗脫，但是色譜峰的出峰順序及分離度易受洗脫溶劑酸性影響。分別考察了0.1%甲酸、0.1%磷酸、不同濃度磷酸二氫鉀水溶液、不同pH的純水流動相對測定結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在pH值為4.50的純水相下，谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑各峰分離效果較好，基線平穩(wěn)?？紤]高水相對色譜柱的損害，固定使用高耐水柱Inertsil ODS-3進(jìn)行檢測，以提高該方法的耐用性和重復(fù)性。
2.1.3 樣品溶液制備方法考察
目標(biāo)成分主要為核苷類及氨基酸類物質(zhì)，水溶性較好。采用水提取雖然各色譜峰響應(yīng)良好、峰形對稱、基線平穩(wěn)，但是考慮到為谷芽提取物，純水提取樣品霉變較快，可能污染儀器并影響結(jié)果，因此考慮采用不同比例有機(jī)相提取。分別考察了10%甲醇、20%甲醇、50%甲醇、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇對谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉提取的影響。當(dāng)采用乙醇作為有機(jī)相提取時，尿嘧啶色譜峰受到干擾。當(dāng)采用不同比例甲醇提取時，發(fā)現(xiàn)提取溶劑有機(jī)相比例達(dá)到50%以上時，色譜峰會變形。當(dāng)采用20%甲醇提取時，色譜峰形良好，雜質(zhì)較少，因此選擇20%甲醇作為提取溶劑。
對樣品制備的提取方式進(jìn)行了考察，比較了超聲提取與加熱回流提取，加熱回流提取時，3#峰次黃嘌呤受到雜質(zhì)干擾，因此選擇超聲提取的方式。分別考察了超聲15、30、45 min對谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜影響，不同超聲時長對應(yīng)的總特征峰面積之和分別為22.569 4、22.549 8、22.340 7，超聲30 min后，各組分的溶出已經(jīng)趨于穩(wěn)定，因此超聲時長設(shè)定為30 min。
2.2 谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜研究
2.2.1 UPLC特征圖譜的建立及方法專屬性
精密吸取1.3.1中3種溶液各2 μL，按照1.2儀器工作條件進(jìn)樣，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，樣品溶液與混合對照品溶液色譜在相同保留時間處呈對應(yīng)色譜峰，各色譜峰理論塔板數(shù)均大于4 000，陰性溶液色譜顯示無干擾，表明方法專屬性較好。
1—尿嘧啶；3—次黃嘌呤； 5—尿苷； 6—腺嘌呤；8—鳥苷；12—色氨酸； 13—腺苷2、4、7、9、10、11—未確認(rèn)峰
圖1 空白溶液、混合對照品溶液、樣品溶液色譜圖
Fig. 1 Chromatogram of blank solution， mixed reference solution and sample solution
2.2.2 共有峰的指認(rèn)及相對保留時間確定采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》對所得谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑的色譜圖進(jìn)行分析，15批谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有13個共有峰。UPLC疊加特征圖譜如圖2所示，生成的共有模式如圖3所示。根據(jù)對照品指認(rèn)，確定1#峰為尿嘧啶、3#峰為次黃嘌呤、5#峰為尿苷、6#峰為腺嘌呤、8#峰為鳥苷、12#峰為色氨酸、13#峰為腺苷。根據(jù)各峰響應(yīng)值、保留時間等影響，確定以6#峰腺嘌呤為S峰，分別計算其他峰與S峰的相對保留時間，規(guī)定值分別為0.30（峰1）、0.41（峰2）、0.53（峰3）、0.64（峰4）、0.73（峰5）、1.55（峰7）、1.62（峰8）、1.72（峰9）、1.75（峰10）、1.79（峰11）、1.84（峰12）、1.96（峰13）。
圖2 15批谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜
Fig. 2 UPLC characteristic chromatograms of 15 batches of Guya Standard decoctions
G1~G15—15批谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉
1—尿嘧啶；3—次黃嘌呤； 5—尿苷； 6—腺嘌呤；8—鳥苷；12—色氨酸； 13—腺苷2、4、7、9、10、11—未確認(rèn)峰
圖3 谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜共有模式圖
Fig. 3 UPLC specific chromatogram of Guya Standard decoctions
2.2.3 特征圖譜精密度試驗
精密稱定同一批次谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉6份，按1.3.1方法制備樣品溶液，按照1.2儀器工作條件進(jìn)樣測定，特征圖譜精密度試驗結(jié)果見表3。由表3可知，以腺嘌呤（6#峰）為參照峰，其余各色譜峰相對保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于0.30%，相對峰面積的RSD小于2.00%，表明該法精密性良好。
表3 特征圖譜精密度試驗結(jié)果
Tab. 3 Test results of UPLC specific chromatograms of precision
2.2.4 特征圖譜穩(wěn)定性試驗取1.3.1中谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉（G1）溶液，于0、2、4、8、12、24 h在1.2儀器工作條件下進(jìn)樣分析，特征圖譜穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表4。
表4 特征圖譜穩(wěn)定性試驗結(jié)果
Tab. 4 Test results of UPLC specific chromatograms of stability
由表4可知，以腺嘌呤為參照峰，其余各色譜峰相對保留時間的RSD小于0.30%，相對峰面積的RSD小于3.00%，表明谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.5 特征圖譜相似度計算結(jié)果
以對照特征圖譜為評價，根據(jù)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，15批谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度依次為0.975、0.986、0.986、0.977、0.986、0.972、0.982、0.982、0.979、0.974、0.972、0.979、0.975、0.971、0.975，均大于0.97，表明多批谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量較為穩(wěn)定，成分差異較小，該方法可靠、穩(wěn)定。
2.3 指標(biāo)成分含量測定
2.3.1 線性方程和檢出限、定量限
精密吸取混合對照品溶液適量，置于容量瓶中，稀釋成6個質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在1.2儀器工作條件下條件測定，以各成分的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。采用信噪比法測定各化合物的檢出限與定量限，逐級稀釋混合對照品溶液并進(jìn)行檢測，當(dāng)信噪比為3時，對應(yīng)的溶液濃度為該化合物的檢出限；當(dāng)信噪比為10時，對應(yīng)的溶液濃度為該化合物的定量限。各成分的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表5。由表5可知，7種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限為0.04~1.04 μg/mL，定量限為0.13~3.47 μg/mL，表明該方法靈敏度較高，適于定量。
表5 7種成分的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限
Tab. 5 Linear range, linear equation, correlation coefficient, detection limit and quantification limit of seven components
2.3.2 穩(wěn)定性試驗
取谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉溶液，在1.2儀器工作條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，試驗結(jié)果見表6。由表6可知，尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷、色氨酸、腺苷峰面積的RSD值分別為0.68%、0.76%、0.42%、1.76%、1.77%、1.43%、0.15%，表明谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
表6 穩(wěn)定性試驗結(jié)果
Tab. 6 Test results of stability
2.3.3 樣品加標(biāo)回收試驗
取同一批次谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉9份，每份約0.25 g，精密稱定，按對照品量與樣品實(shí)際目標(biāo)物質(zhì)含量分別為0.8∶1、1∶1、1.2∶1的比例精密加入混合對照品溶液，每一比例平行3份，在1.2儀器工作條件下進(jìn)樣，分別測定7個目標(biāo)成分的含量，計算加樣回收率，試驗結(jié)果見表7。由表7可知，樣品加標(biāo)平均回收率為98.65%～100.13%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35%～1.46%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度。
表7 樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果
Tab. 7 Test results of sample spike recovery
3 結(jié)語
建立了谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜方法，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價，確定了谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜中13個特征峰。通過對照品指認(rèn)，確認(rèn)了其中7個特征峰，并對這7種核苷類及氨基酸類進(jìn)行了含量測定。該方法準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，分析速度快，有利于谷芽標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制，為進(jìn)一步提升標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。
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來源：化學(xué)分析計量
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