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二硫鍵的基本作用

二硫鍵對于抗體類藥物分子維持高級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及保持其生物學(xué)活性具有重要的作用。對于單抗分子，多對鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵可有效地維持其兩條輕鏈及兩條重鏈結(jié)構(gòu)的完整性；而對于雙抗、多功能抗體等創(chuàng)新結(jié)構(gòu)分子而言，二硫鍵對于其能否形成正確分子結(jié)構(gòu)及維持穩(wěn)定性具有更為重要的作用。

根據(jù)行業(yè)技術(shù)報道，在抗體藥物放大規(guī)?；a(chǎn)過程中，二硫鍵還原的現(xiàn)象時有發(fā)生，從而造成質(zhì)量問題甚至生產(chǎn)失敗，因此需要我們持續(xù)關(guān)注。本文就這一問題的科學(xué)原因、影響因素和預(yù)防措施做一個精簡總結(jié)。

二硫鍵還原的成因及影響因素

在抗體類藥物生產(chǎn)過程中，若細胞發(fā)生裂解，則會釋放出參與氧化還原反應(yīng)的蛋白酶，如硫氧還蛋白還原酶（Thioredoxin reductase, TrxR）、谷胱甘肽還原酶（Gluathione reductase，GR）等，以及相關(guān)輔助分子，如NADPH等，從而引起藥物分子二硫鍵的還原，其相關(guān)影響因素包括：

（1）細胞收獲時的剪切力：當(dāng)對細胞進行收獲時，若剪切力過大，則會造成更多細胞裂解，從而釋放更多的酶和輔助分子引起抗體分子二硫鍵的還原；

（2）溶氧：當(dāng)細胞收獲液中溶氧不夠時，則無法消耗足夠的NADPH，從而使其更利于二硫鍵的還原；

（3）pH：當(dāng)pH維持在近中性時，由于NADPH更容易被氧化，因此pH接近中性的細胞收獲液更容易發(fā)生抗體分子二硫鍵的還原；

（4）溫度：當(dāng)存儲溫度更低時，氧化還原反應(yīng)速率降低，從而可減緩二硫鍵還原的發(fā)生。

預(yù)防二硫鍵還原的基本策略

根據(jù)現(xiàn)有經(jīng)驗，可以通過以下措施減少或避免抗體分子二硫鍵在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生還原：

（1）通過添加抑制劑阻止相關(guān)還原酶的表達，從而避免或降低二硫鍵的還原，但應(yīng)注意抑制劑的添加不會影響細胞生長以及目標(biāo)蛋白的表達，同時，若有多種還原酶參與了二硫鍵的還原，則可能需要添加多種蛋白酶表達抑制劑；

（2）通過添加EDTA、金屬離子等抑制相關(guān)還原酶的活性，從而避免或降低二硫鍵的還原，但應(yīng)考慮在工藝過程中的添加時機以及如何有效去除，從而避免其對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生其他影響；

（3）通過提高溶氧、引入過氧化氫及L-胱氨酸等可與相關(guān)還原酶相互作用的分子，消耗相關(guān)還原酶，從而避免或降低二硫鍵的還原；

（4）通過減少細胞收獲步驟的剪切力，使得相關(guān)還原酶的釋放減少，從而避免或降低二硫鍵的還原；

（5）通過調(diào)節(jié)細胞收獲液的pH以及降低細胞收獲液的儲存溫度，從而延緩二硫鍵的還原，但使用該策略應(yīng)注意產(chǎn)品分子質(zhì)量不受pH和溫度調(diào)節(jié)的影響。

小結(jié)

基于二硫鍵對維持抗體類分子構(gòu)象及活性的重要性，在生產(chǎn)工藝過程中，應(yīng)持續(xù)關(guān)注不同工藝條件對二硫鍵的影響。若發(fā)現(xiàn)二硫鍵產(chǎn)生還原現(xiàn)象，應(yīng)積極尋找及確認相關(guān)原因，并適時調(diào)整相關(guān)工藝，從而最大程度避免上述問題。

奕安濟世在大規(guī)模生產(chǎn)中已經(jīng)應(yīng)用成熟可靠的預(yù)防措施，可有效避免和解決抗體類分子二硫鍵非預(yù)期還原問題，保障規(guī)?；a(chǎn)的工藝穩(wěn)健性和產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性。