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在基于液相-質(zhì)譜（LC-MS）的方法分析生物樣本的藥物時(shí)，樣品的一些共同提取物可能對目標(biāo)化合物的離子化效率產(chǎn)生影響，這個(gè)影響可以從儀器響應(yīng)上觀察到，化合物的信號會增強(qiáng)或更常見的是被抑制，這種現(xiàn)象被稱為基質(zhì)效應(yīng)。

2.基質(zhì)效應(yīng)的常見原因有哪些？

在LC-MS/MS 分析過程中，生物樣本中的很多物質(zhì)都可能產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。這些基質(zhì)效應(yīng)的物質(zhì)一定存在于最終提取完成的樣品中并且在色譜系統(tǒng)中與化合物或（和）內(nèi)標(biāo)一起洗脫下來。然而，即使出現(xiàn)這些共同洗脫的物質(zhì)，基質(zhì)效應(yīng)也并不一定會影響到分析方法，因?yàn)榛|(zhì)效應(yīng)的大小取決于方法中使用的大氣壓離子化（API）類型（APCI相比ESI不易受到基質(zhì)效應(yīng)的影響）、干擾物的相對濃度及校正標(biāo)樣或同位紊內(nèi)標(biāo)的抵消作用的大小。

引起基質(zhì)效應(yīng)的物質(zhì)根據(jù)其來源可被分為內(nèi)源性和外源性兩大類。

內(nèi)源性主擾物：通常是存在于生物樣本中的一些有機(jī)物（蛋白質(zhì)，脂肪，磷脂等）和無機(jī)物，可能還包括體內(nèi)形成的一此代謝產(chǎn)物。目前，血漿是藥物研發(fā)行業(yè)用來進(jìn)行樣本分析最常見的生物液體，一般含有高濃度的鹽，蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂，還有少量碳水化合物、多肽及其他有機(jī)化合物，所有這些組分都有可能導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)。

比如磷脂，它可能是引起基質(zhì)效應(yīng)的主要原因之一，特別是通過一般的蛋白質(zhì)沉淀（PPT)方法不能有效去除磷脂，可考慮使用LLE提取待測物，可以盡可能的消除磷脂帶來的影響。此外，由于脂類長鏈的疏水性，這些化合物一般在反相（RP)色譜條件下會比較晚地被洗脫出來，因此更容易與化合物一起被洗脫，而成為干擾的來源。與此相對的是高極性的鹽類，其在液相色譜（LC)中無法保留，一般會在化合物洗脫之前的死時(shí)間被洗脫下來，也可能產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。

外源性主擾物：自于樣品制備過程或者樣本處理中引入的外來物質(zhì)。例如抗凝劑肝素鋰，用于樣品采集和儲存的容器中的增塑劑，緩沖液，離子對試劑以及藥物制劑中加入的輔料，特別是吐溫－80和PEG-400都可能引起基質(zhì)效應(yīng)

目前普遍認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生是質(zhì)譜離子源中樣品離子化過程中，由內(nèi)源性或外源性基質(zhì)物質(zhì)與目標(biāo)化合物競爭電荷和中和離子化過程引起的。下面以最常用的ESI（電噴霧離子源）為例說明，液相分離的液態(tài)樣品在進(jìn)入質(zhì)譜分析前，必須在質(zhì)譜的前端離子源將液態(tài)樣品去溶劑，并使得目標(biāo)化合物帶上電荷形成分子離子，才能被四極桿質(zhì)譜分離捕獲，檢測到樣品信號。

如圖2-18 液態(tài)樣品在毛細(xì)管噴針處經(jīng)電場帶電后，液滴在電場力的作用下形成泰勒錐并在尖端形成一系列微小的帶點(diǎn)液滴，這些帶點(diǎn)液滴在離子源處受到輔助加熱氣（氮?dú)猓┑淖饔孟驴焖僬舭l(fā)，由于溶劑大量蒸發(fā)，原本小的帶電液滴表面積聚大量的帶電電荷發(fā)生庫倫爆炸的過程（見下圖），最終形成氣相的帶電分子離子進(jìn)入質(zhì)譜。

根據(jù)離子化過程的原理，基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生可能機(jī)制有以下五種。

① 其中最主要的是電荷競爭機(jī)制，待測物在高濃度范圍時(shí)，在離子轉(zhuǎn)移到氣相中時(shí)，首先要求離子到達(dá)液滴的表面，而高濃度的基質(zhì)組分可以限制待測物到達(dá)液滴表面并競爭其的帶電位置，例如一些疏水性的脂類或表面活性劑（吐溫類），流動(dòng)相添加劑，離子對試劑等，從而抑制了待測物的離子化效率。

②另外有些基質(zhì)組分還可以影響液滴的黏稠度和表面張力，減少了液滴的生成和接下來的溶劑蒸發(fā)，使得到達(dá)氣相的離子減少，信號被抑制。

③同時(shí)基質(zhì)效應(yīng)也可能取決于待測化合物的類別和極性，極性較高的化合物會集中在液滴的水相內(nèi)部而不會留在表面，因此化合物的表面張力較低傾向于產(chǎn)生更多的離子抑制。

④基質(zhì)中和流動(dòng)相中非揮發(fā)性的組分也可能是有害的，它會在帶點(diǎn)液滴揮發(fā)的過程中于待測物形成共沉淀物的固態(tài)顆粒，使得信號抑制。

⑤在氣相中，待測物離子仍易受同時(shí)進(jìn)入氣相的基質(zhì)組分的影響，中性基質(zhì)組分可能通過氣相中的質(zhì)子傳遞反應(yīng)與帶電的待測物競爭電荷，并且那些帶有較高堿度的氣相將會除掉待測物的質(zhì)子，中和其電荷造成信號抑制。

雖然真正的基質(zhì)效應(yīng)抑制機(jī)制可能還不能完全明確，但一般來說基質(zhì)效應(yīng)是由競爭電荷或中和離子化過程引起的，相反的，當(dāng)基質(zhì)中含有增強(qiáng)離子化效率或氣相轉(zhuǎn)移的成分時(shí)會增強(qiáng)離子化過程，導(dǎo)致信號增強(qiáng)。

最常用的基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)方法是在標(biāo)準(zhǔn)分析方法中比較提取樣品和純?nèi)芤旱捻憫?yīng)，其中化合物的絕對基質(zhì)效應(yīng)定義為基質(zhì)效應(yīng)因子（MF），其計(jì)算方式為：在不考慮回收率的情況下，比較待測物在基質(zhì)組分存在和不含有基質(zhì)組分的條件下響應(yīng)，MF=提取后的空白基質(zhì)加入待測物的響應(yīng)/純?nèi)芤褐写郎y物的響應(yīng)。由于同位素內(nèi)標(biāo)的化學(xué)性質(zhì)和待測物是一樣的，所以在樣品的提取和離子化過程中可以最大程度的抵消基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響。

MF=1時(shí)，表明沒有基質(zhì)效應(yīng)。

MF<1時(shí)，代表離子抑制。

MF>1時(shí)，代表離子增強(qiáng)。

當(dāng)檢測的樣品來自不同的個(gè)體的基質(zhì)，而出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)不均一導(dǎo)致的檢測結(jié)果誤差，所以分析中需要引入同一濃度的待測化合物的類似物或者同位素化合物作為內(nèi)標(biāo)錨定，所以這里引入了內(nèi)標(biāo)歸一化后的基質(zhì)效應(yīng)因子MFi,

根據(jù)指導(dǎo)原則，一般認(rèn)為內(nèi)標(biāo)歸一化后的MFi的范圍在0.8-1.2時(shí)可以接受的，同時(shí)不同批基質(zhì)測得的MFi的CV應(yīng)當(dāng)小于15%，當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)較為嚴(yán)重的情況下，建議使用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)，由于同位素內(nèi)標(biāo)的化學(xué)性質(zhì)和待測物是一樣的，所以在樣品的提取和離子化過程中可以最大程度的抵消基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響。

在了解基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)制后，可以從以下五個(gè)方面考慮。

① 在樣品的前處理階段，可以選擇性的去除干擾物而減少基質(zhì)效應(yīng)，在常見的預(yù)處理方法主要是PPT，由于其方法過程簡單，適用待測物廣泛，成本低廉所以最為常用，但是對于樣品的凈化方面來說，PPT容易引入產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的物質(zhì)，其中包括了很多基質(zhì)組分和磷脂，當(dāng)產(chǎn)生較為嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)時(shí)，最簡易的方法是更換適當(dāng)提取劑，例如從甲醇體系換為乙腈體系，或者加入適當(dāng)?shù)乃?，改變PH可以幫助減少基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)PPT仍不能改善時(shí)，可以考慮LLE或者SPE的樣品提取手段，LLE可以很大程度上消除基質(zhì)組分帶來的基質(zhì)效應(yīng)影響。

② 選擇合適的內(nèi)標(biāo)，利用內(nèi)標(biāo)抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響時(shí)最常見的思路，如果內(nèi)標(biāo)和待測物受到同樣程度的抑制和增強(qiáng)的話，任何離子化條件的變化只會影響到絕對的峰面積，而不會影響待測物和內(nèi)標(biāo)的比值，因此可以抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響，為了最大程度的抵消和降低基質(zhì)效應(yīng)，內(nèi)標(biāo)應(yīng)當(dāng)具有待測物類似的物理化學(xué)性質(zhì)，離子化效率和色譜保留時(shí)間，所以在遇到基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重，普通內(nèi)標(biāo)不能解決時(shí)，推薦使用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)（SIL-IS）。

③ 調(diào)整合適的液相分離條件，由于基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生是基質(zhì)組分與待測物同時(shí)洗脫，在離子源的中和抑制產(chǎn)生，所以通常可以修改色譜條件來降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，通過改變梯度條件，流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度和PH都可以有效的改變待測物的保留時(shí)間，使其遠(yuǎn)離離子抑制區(qū)域，通常PPT的方法中引起基質(zhì)效應(yīng)最為常見的是磷脂，而在進(jìn)行高通量的項(xiàng)目時(shí)，磷脂容易在常規(guī)的C18柱潴留，使得基質(zhì)效應(yīng)越來越明顯，同時(shí)相比乙腈，磷脂在甲醇體系的溶解度更高，所以可以增加流動(dòng)相或者洗液中甲醇比例來減少磷脂帶來的基質(zhì)效應(yīng)影響。

④ 減少進(jìn)入LC-MS系統(tǒng)的樣品量或者對樣品進(jìn)行稀釋后進(jìn)樣，這是在不大幅更改方法來降低基質(zhì)效應(yīng)的常用方法，通常基質(zhì)效應(yīng)隨著進(jìn)入的載樣量或樣品濃度的提高，而逐漸增加，只要靈敏度允許的范圍內(nèi)，就可以很簡單的通過減少進(jìn)樣量和進(jìn)樣前稀釋樣品而減低基質(zhì)效應(yīng)。

⑤ 選擇合適的API離子源和離子極性，相對ESI源，APCI源可以更少受到基質(zhì)效應(yīng)的影響，如果待測物的熱穩(wěn)定性好而且靈敏度不是問題，那么從ESI轉(zhuǎn)到APCI是有效降低基質(zhì)效應(yīng)的方法，同時(shí)，一般認(rèn)為負(fù)離子模式選擇性更好，有更好的離子抑制，但是許多待測物無法在負(fù)離子模式下分析，而且離子化模式的選擇性也受制于方法的靈敏度，當(dāng)離子源不能優(yōu)化時(shí)，可以上訴上四個(gè)方面去改善。