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摘要

目的：全面梳理寡核苷酸藥物的基本情況及其質(zhì)控手段（尤其是有關(guān)物質(zhì)分析技術(shù)），為更為精準(zhǔn)的控制寡核苷酸藥物的產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

方法：通過檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)寡核苷酸藥物的雜質(zhì)種類、創(chuàng)新色譜法和質(zhì)譜法等在寡核苷酸雜質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)表征、精準(zhǔn)定量等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行整理、分析和歸納。

結(jié)果：已上市的寡核苷酸藥物主要有3類，質(zhì)量控制主要參考國(guó)外相關(guān)指南，離子對(duì)反相色譜法、離子交換色譜法和質(zhì)譜法常用于寡核苷酸藥物質(zhì)量控制，同時(shí)其他分析技術(shù)具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

結(jié)論：寡核苷酸質(zhì)量控制取得了很大進(jìn)展，但在國(guó)內(nèi)缺少針對(duì)性指導(dǎo)原則。另外，現(xiàn)有寡核苷酸藥物分析方法仍存在一些問題。需深入研究，開發(fā)新方法，為寡核苷酸藥物質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

 

關(guān)鍵詞

寡核苷酸；反義寡核苷酸；小干擾核糖核酸；核酸適配體；質(zhì)量控制；有關(guān)物質(zhì)；液相色譜法；質(zhì)譜法；液質(zhì)聯(lián)用

 

核酸是生命體發(fā)揮生命活動(dòng)必不可少的組成物質(zhì)。目前，已證明有明確靶點(diǎn)的疾病許多都與核酸的錯(cuò)誤表達(dá)有關(guān)。隨著現(xiàn)代DNA/RNA合成技術(shù)以及生物學(xué)手段的不斷進(jìn)步，尤其是新冠mRNA疫苗的成功應(yīng)用，證明了開發(fā)以核酸結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)治療和預(yù)防疾病的藥物，正在成為未來人類解決尚未被滿足臨床需求問題的重要方向。

寡核苷酸是核酸藥物的重要組成之一。其由嘌呤或嘧啶堿基、核糖或脫氧核糖以及磷酸基組成的短線聚合物，被認(rèn)為是繼小分子藥物、蛋白藥物和抗體藥物之后的新一代藥物，被視為生物醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域最具有前途的藥物。與傳統(tǒng)的小分子藥物相比，寡核苷酸藥物具有高特異性、高效和長(zhǎng)效的優(yōu)勢(shì)，可以在基因?qū)用嫔险{(diào)控被傳統(tǒng)小分子藥物認(rèn)為“無成藥性”的蛋白質(zhì)的表達(dá)，應(yīng)用范圍廣。

盡管寡核苷酸藥物的發(fā)展勢(shì)頭迅猛，但是其質(zhì)量控制方面仍存在一系列亟待解決的科學(xué)問題。為了促進(jìn)寡核苷酸藥物質(zhì)量的全面提升，亟需開發(fā)先進(jìn)的分析方法，實(shí)現(xiàn)寡核苷酸的精準(zhǔn)質(zhì)控。本文將介紹寡核苷酸藥物的種類，對(duì)寡核苷酸藥物的國(guó)內(nèi)外指南情況、寡核苷酸藥物的化學(xué)修飾和遞送策略以及其質(zhì)控中主要關(guān)注的雜質(zhì)類型進(jìn)行綜述，并總結(jié)了近年來色譜法、質(zhì)譜法（MS）以及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）在寡核苷酸藥物有關(guān)物質(zhì)研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

 

1寡核苷酸藥物的種類

截止今年（2024年）上半年，已有20種寡核苷酸藥物在國(guó)外獲批上市（表1），包括反義寡核苷酸（Antisense Oligonucleotide, ASO）、小干擾核糖核酸（Small Interfering RNA, siRNA）和核酸適配體（Aptamer）。

注：1 GalNAc.N-乙酰半乳糖胺；2 LNP.脂質(zhì)納米顆粒；3 PEG.聚乙二醇

Note: 1GalNAc. N-acetylgalactosamine; 2LNP. Lipid Nanoparticle; 3PEG. Polyethylene glycol

1.1 ASO

ASO是一種合成的、含13~30個(gè)核苷酸、具有多種化學(xué)性質(zhì)的單鏈聚合物，可以結(jié)合與之互補(bǔ)的RNA靶點(diǎn)。當(dāng)ASO與互補(bǔ)RNA結(jié)合之后，主要通過RNA降解機(jī)制和空間為主機(jī)制2種發(fā)揮作用（圖1）。

1.2 siRNA

siRNA是一種含有約20~30個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA，其中1條鏈稱為引導(dǎo)鏈，也叫反義鏈，具有藥理活性；另1條鏈稱為隨從鏈，也叫正義鏈。siRNA主要通過RNA干擾（RNAi）機(jī)制起作用（圖1）。

1.3 Aptamer

Aptamer是約含有20~100個(gè)核苷酸的單鏈DNA或RNA分子。Aptamer的作用機(jī)制不同于ASO和siRNA（圖1），不依賴于堿基配對(duì)原則，而是依靠獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)特異性識(shí)別金屬離子、蛋白和細(xì)胞，具有很高的親和力。

1.4 微小核糖核酸（microRNA，miRNA）

miRNA是含有大約18~25個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，可以與序列互補(bǔ)的mRNA結(jié)合，導(dǎo)致翻譯后的抑制、降解和沉默，其失調(diào)會(huì)導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生。miRNA的作用機(jī)制也是RNAi機(jī)制，但相對(duì)于外源性設(shè)計(jì)的siRNA，miRNA是內(nèi)源性產(chǎn)生的，無法分配給他們特定的沉默任務(wù)，易引起不良反應(yīng)。目前尚未有miRNA藥物上市。

 

2國(guó)內(nèi)外寡核苷酸藥物質(zhì)量控制的指南

寡核苷酸藥物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與小分子化學(xué)藥品有較大差異。因此，現(xiàn)有的與質(zhì)量控制相關(guān)的人用藥品技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)理事會(huì)（ICH）指導(dǎo)原則[Q3A（R2）、Q3B、Q6A和M7]無法完全適用于寡核苷酸藥物。但近幾年各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)發(fā)布的寡核苷酸藥物質(zhì)量控制的相關(guān)指南可供參考。

2.1 中國(guó)

目前，我國(guó)寡核苷酸藥物質(zhì)量控制指導(dǎo)原則方面亟待發(fā)展和完善，但部分內(nèi)容如殘留溶劑等可參考《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）。

2.2 美國(guó)

美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）于2021年發(fā)布了針對(duì)ASO的化學(xué)、工藝和質(zhì)控的指南，列出了針對(duì)目前寡核苷酸藥物鑒別、檢查等方面的建議，為寡核苷酸藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定起到了一定參考作用，如對(duì)于寡核苷酸藥物的鑒別，F(xiàn)DA的指南中建議選擇2種或2種以上方法進(jìn)行鑒別，為多款新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制修訂起到了指導(dǎo)作用。

2.3 日本

日本藥品與醫(yī)療器械管理局（PMDA）在2018年發(fā)布了寡核苷酸療法質(zhì)量保證和評(píng)價(jià)考慮要點(diǎn)，該文件中涵蓋了寡核苷酸雜質(zhì)控制的相應(yīng)內(nèi)容，但由于該要點(diǎn)發(fā)布時(shí)間較早，當(dāng)時(shí)全球?qū)τ诠押塑账崴幬锶圆粔蛄私?，所以提出的部分?nèi)容和建議并不詳細(xì)。

2.4 歐洲

歐洲制藥業(yè)成立的寡核苷酸聯(lián)盟（EPOC）從2020年開始發(fā)布一系列針對(duì)這類藥品的白皮書，涉及鑒別、有關(guān)物質(zhì)、工藝過程控制和穩(wěn)定性研究等藥學(xué)研究策略，成為國(guó)內(nèi)外已上市寡核苷酸藥物研發(fā)中重要的參考性文件之一。2024年7月，歐洲藥品管理局（EMA）發(fā)布了寡核苷酸藥物開發(fā)和生產(chǎn)指南，其內(nèi)容涵蓋了寡核苷酸藥物的制造過程、表征、規(guī)格和分析控制的各個(gè)方面，是目前最為詳盡的描述寡核苷酸藥物質(zhì)量控制策略的權(quán)威指南之一，其中提出了寡核苷酸手性異構(gòu)體、二級(jí)結(jié)構(gòu)（包括Aptamer的三級(jí)結(jié)構(gòu)）、熱力學(xué)轉(zhuǎn)變等鑒別的新要求。

即便如此，寡核苷酸藥物作為近年來逐漸發(fā)展起來的創(chuàng)新化藥品類，質(zhì)控難度較大，方法開發(fā)困難，且目前全球各國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)在質(zhì)量控制方法開發(fā)與標(biāo)準(zhǔn)化方面均缺乏相關(guān)的指導(dǎo)原則可供參考，這一問題也為這類創(chuàng)新藥品類質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化帶來了極大挑戰(zhàn)。

 

3寡核苷酸藥物的化學(xué)修飾與遞送系統(tǒng)

與其他藥物相比，寡核苷酸具有藥效持久，特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。但寡核苷酸藥物在提高自身穩(wěn)定性和有效遞送到靶標(biāo)部位等方面仍然存在一系列亟待解決的問題。目前，解決這些問題的策略主要有對(duì)寡核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾或通過遞送系統(tǒng)以達(dá)到靶向遞送。

寡核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾主要包括對(duì)磷酸骨架、核糖或脫氧核糖以及堿基修飾（圖2）。其中，用硫原子取代磷酸二酯（PO）骨架中的非橋接氧原子形成硫代磷酸酯（PS）的方法比較常用，可以提高寡核苷酸對(duì)核酶的穩(wěn)定性，但當(dāng)PO骨架中的非橋接氧原子被硫取代時(shí)，非手性PO鍵轉(zhuǎn)化為手性PS中心，將會(huì)產(chǎn)生2n個(gè)非對(duì)映異構(gòu)體，其中n為PS修飾的數(shù)量。有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸藥物的藥效一定程度上與非對(duì)映異構(gòu)體的組成有關(guān)，開發(fā)寡核苷酸藥物的非對(duì)映異構(gòu)體組成分析方法具有重要意義。

在寡核苷酸的遞送系統(tǒng)方面，已上市和在研的藥品主要有載體遞送和生物偶聯(lián)遞送兩種策略。載體遞送材料主要有脂質(zhì)體、聚合物和外泌體等。其中，LNP是應(yīng)用廣泛，具有載藥量高的優(yōu)勢(shì)，但其存在有毒物質(zhì)蓄積等方面的問題。目前，應(yīng)用最廣的生物偶聯(lián)遞送策略是將寡核苷酸與GalNAc連接，但GalNAc策略只能靶向肝臟，難以用于非肝臟靶點(diǎn)疾病治療。除此以外，研究較廣的生物偶聯(lián)配體還有細(xì)胞穿膜肽，有希望用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物的遞送。

復(fù)雜的修飾基團(tuán)與遞送系統(tǒng)，使得本就結(jié)構(gòu)復(fù)雜的寡核苷酸藥物的質(zhì)控難度進(jìn)一步提升。近年來，隨著二維液相色譜法（2D-LC）、LC-MS等一系列創(chuàng)新技術(shù)成功應(yīng)用，寡核苷酸藥物的質(zhì)控水平也在不斷提升。

 

4寡核苷酸藥物有關(guān)物質(zhì)分析

有關(guān)物質(zhì)分析是寡核苷酸藥物的質(zhì)控難點(diǎn)。EPOC的白皮書和EMA發(fā)布的寡核苷酸藥物開發(fā)和生產(chǎn)指南中，將寡核苷酸的產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)分為4類。I類雜質(zhì)為與寡核苷酸主成分結(jié)構(gòu)和序列相同的主要代謝物雜質(zhì)，如缺少3'或5'端一個(gè)或多個(gè)核苷酸的雜質(zhì)，或雙鏈寡核苷酸中的單鏈雜質(zhì)。II類雜質(zhì)是指僅含有天然核酸結(jié)構(gòu)元素的雜質(zhì)，例如硫代磷酸酯寡核苷酸中的磷酸二酯寡核苷酸雜質(zhì)（PO雜質(zhì)）。III類雜質(zhì)指的是母體寡核苷酸的序列變異雜質(zhì)，如鏈內(nèi)缺失或添加核苷酸的n-1、n-2或n+1雜質(zhì)（而非在3'或5'末端），這類雜質(zhì)通常與母體寡核苷酸藥物難以區(qū)分。IV類雜質(zhì)指含有母體寡核苷酸或天然核酸中不存在的結(jié)構(gòu)元素的雜質(zhì)，如無堿基雜質(zhì)和N3-（2-氰乙基）胸腺嘧啶（CNET）雜質(zhì)，各類雜質(zhì)的典型雜質(zhì)結(jié)構(gòu)見表2。

色譜技術(shù)被認(rèn)為是用于寡核苷酸藥物質(zhì)量控制研究最重要的分析手段。在色譜分析中，液相色譜法和毛細(xì)管電泳法廣泛應(yīng)用于寡核苷酸藥物的質(zhì)量控制。

4.1 液相色譜法

4.1.1 離子對(duì)反相液相色譜法

離子對(duì)反相液相色譜法（Ion-Pair Reversed-Phase Liquid Chromatography，IP-RPLC）是分析寡核苷酸和其雜質(zhì)最常用的液相色譜方法，根據(jù)疏水相互作用和靜電相互作用將寡核苷酸主成分與其雜質(zhì)進(jìn)行分離。在IP-RPLC中，如何選擇分析條件使分析物在合理的時(shí)間內(nèi)得到良好的分離依舊是研究者面臨的重要挑戰(zhàn)。

通過改變離子對(duì)試劑和有機(jī)溶劑的種類及其在流動(dòng)相中的比例，可以提高IP-RPLC對(duì)寡核苷酸的選擇性。目前，六氟異丙醇（HFIP）和三乙胺（TEA）是分離寡核苷酸的首選流動(dòng)相組成成分。ENMARK等和ZUZANA等對(duì)寡核苷酸藥物有關(guān)物質(zhì)的分離條件進(jìn)行了系統(tǒng)性研究，為IP-RPLC方法的開發(fā)提供參考。

總體來講，IP-RPLC適用于分析寡核苷酸藥物的大多數(shù)雜質(zhì)，尤其是n-1/n+1雜質(zhì)，與MS聯(lián)用被認(rèn)為是寡核苷酸檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但存在PO雜質(zhì)共流出問題，與MS聯(lián)用存在一定程度的離子抑制。

4.1.2 離子交換色譜法

離子交換色譜法（Ion exchange chromatography，IEC）在寡核苷酸相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛，基于電荷差異對(duì)分析物進(jìn)行分離。由于流動(dòng)相的鹽濃度高，在使用MS進(jìn)行后續(xù)測(cè)定時(shí)，需要進(jìn)行脫鹽處理，操作繁瑣。但I(xiàn)EC通常色譜柱壓力較低，成本也較低，易于應(yīng)用在放大純化寡核苷酸藥物中。另外，IEC對(duì)PO雜質(zhì)的分離效果好，常與IP-RPLC結(jié)合用于寡核苷酸的純度分析。

ROUSSIS等使用弱陰離子交換法首次分離出了脫氨基雜質(zhì)。TOGAWA等研究了siRNA雙鏈及其雜質(zhì)在IEC中的保留行為。該團(tuán)隊(duì)還將IEC應(yīng)用于硫代siRNA非對(duì)映異構(gòu)體的分離，在單鏈水平上較好地分離了非對(duì)映異構(gòu)體。

4.1.3 親水相互作用色譜法

親水相互作用色譜法（Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）是一種不需添加離子對(duì)試劑分析極性分子的色譜技術(shù)，化合物按極性增加的順序被洗脫。GILAR等研究發(fā)現(xiàn)，HILIC對(duì)不同類型的n-1雜質(zhì)和PO雜質(zhì)的分離選擇性與IP-RPLC不同，有望與其他色譜法相結(jié)合用于寡核苷酸藥物質(zhì)量控制。由于流動(dòng)相中揮發(fā)性有機(jī)溶劑的含量較高，相對(duì)于反相色譜，HILIC與MS耦合的兼容性較好，但與IP RPLC相比，與MS聯(lián)用的靈敏度低。另外，HILIC還可以作為一種脫鹽方法。

4.1.4 二維液相色譜法

寡核苷酸藥物有關(guān)物質(zhì)類型多樣，與母體結(jié)構(gòu)高度相似，單一的分離模式往往不能夠?qū)λ械碾s質(zhì)都實(shí)現(xiàn)良好的分離。如通過IEC可以有效地分離長(zhǎng)度不同的雜質(zhì)，但其并不適合分離序列變化不大的雜質(zhì)。2D-LC為雜質(zhì)共流出問題提供一種有效的解決方案。VANHINSBERGH等開發(fā)了一種多中心切割的2D-LC方法，結(jié)合紫外線檢測(cè)，減少了雜質(zhì)共流出，提高了對(duì)大小和序列相差不大的寡核苷酸雜質(zhì)的選擇性。LI等將2D-LC用于寡核苷酸非對(duì)映異構(gòu)體的研究中。另外，可以將2D作為IEC的脫鹽裝置，是IEC直接與MS聯(lián)用的。

色譜分析目前仍然是寡核苷酸藥物有關(guān)物質(zhì)分析的重要手段，行業(yè)普遍認(rèn)可的控制策略是將多種色譜分析方法并存于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，綜合評(píng)判寡核苷酸藥物的產(chǎn)品質(zhì)量。

4.2 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法（Capillary Electrophoresis，CE）是一種非常有效的寡核苷酸分離技術(shù)，根據(jù)帶負(fù)電的寡核苷酸在電場(chǎng)作用下的不同遷移速率來進(jìn)行分離。與液相色譜法相比，CE可以產(chǎn)生更好的峰形和更高的分辨率，而且不需要使用會(huì)抑制MS信號(hào)的離子對(duì)試劑，另外，由于毛細(xì)管的內(nèi)徑較小，在樣品體積小的情況下可以獲得較高的靈敏度。盡管CE的分離能力較強(qiáng)，并具有多種分離模式可供使用。但CE的重復(fù)性和耐用性比液相色譜法低，與MS聯(lián)用也存在諸多挑戰(zhàn)。

4.3 質(zhì)譜法

MS是表征寡核苷酸及其相關(guān)雜質(zhì)或代謝物的常用工具之一，在藥物分析領(lǐng)域占據(jù)著重要地位。然而，對(duì)于結(jié)構(gòu)性質(zhì)復(fù)雜的寡核苷酸藥物及其有關(guān)物質(zhì)，僅使用LC或MS對(duì)其進(jìn)行分析達(dá)到的結(jié)果是不理想的，往往需要二者的結(jié)合。LC-MS在分離選擇性和準(zhǔn)確度等方面具有優(yōu)勢(shì)，已成為寡核苷酸藥物質(zhì)量控制中應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)技術(shù)。

GAWLIG等開發(fā)了一種液相色譜聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）定量寡核苷酸的方法。RENTEL等開發(fā)了一種結(jié)合紫外（UV）和MS的IP-RPLC方法，可以識(shí)別和定量寡核苷酸共洗脫雜質(zhì)，常用于確定原料藥和藥品的含量、純度和雜質(zhì)。

目前，LC-MS技術(shù)已經(jīng)越來越多應(yīng)用于寡核苷酸藥物質(zhì)量控制中，其較強(qiáng)分離能力（不僅能夠?qū)崿F(xiàn)色譜分離，還能夠依據(jù)相對(duì)分子量進(jìn)行分離）使得寡核苷酸藥物的精準(zhǔn)質(zhì)量控制成為可能，基于LC-MS技術(shù)將是未來寡核苷酸這類創(chuàng)新化學(xué)藥品有關(guān)物質(zhì)分析與含量測(cè)定的重要方向。

 

5寡核苷酸藥物的鑒別

在寡核苷酸的鑒別方面，由于這類藥物主成分與有關(guān)物質(zhì)之間難以實(shí)現(xiàn)有效分離，無法采用色譜保留時(shí)間（像其他小分子藥物）比對(duì)的方式準(zhǔn)確鑒別。并且由于其結(jié)構(gòu)單元的高度相似性，采用紅外、UV等光譜技術(shù)也無法實(shí)現(xiàn)特異性鑒定該類產(chǎn)品目標(biāo)。除此之外，寡核苷酸藥物的高級(jí)結(jié)構(gòu)可能會(huì)影響藥物的安全性與有效性，因此，針對(duì)性地鑒別其高級(jí)結(jié)構(gòu)也是保障產(chǎn)品質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。EMA的寡核苷酸藥物指導(dǎo)原則中介紹了寡核苷酸的表征技術(shù)，并明確提出寡核苷酸結(jié)構(gòu)表征應(yīng)重點(diǎn)提供二級(jí)結(jié)構(gòu)等關(guān)鍵信息。

5.1 熔融溫度（熔化溫度）法

寡核苷酸的熔融溫度（Melting Temperature，Tm）是指50%寡核苷酸雙鏈解離的溫度，是反映寡核苷酸雙鏈穩(wěn)定性的一個(gè)指標(biāo)。其與寡核苷酸的堿基組成、序列長(zhǎng)度有關(guān)，隨著溫度的變化，寡核苷酸雙鏈解離，UV吸光度發(fā)生改變，因此，可以利用這種性質(zhì)對(duì)寡核苷酸進(jìn)行序列匹配性鑒別。

5.2 圓二色譜法

寡核苷酸的序列、化學(xué)修飾會(huì)影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響其安全性與有效性，因此，可以從CD光譜中判斷出寡核苷酸藥物的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，確保其質(zhì)量與安全。

5.3 核磁共振技術(shù)

核磁共振技術(shù)（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）可以用于確定寡核苷酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括堿基對(duì)的數(shù)量。核磁共振結(jié)構(gòu)指紋識(shí)別方法最近被引入到寡核苷酸藥物終產(chǎn)品藥學(xué)研究中，未來有望應(yīng)用于寡核苷酸藥物結(jié)構(gòu)的深度解析與質(zhì)控中。

5.4 高分辨質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)

高分辨質(zhì)譜（HRMS）是快速、準(zhǔn)確解析寡核苷酸結(jié)構(gòu)的理想工具，能夠直接、全面表征寡核苷酸序列化學(xué)修飾。HRMS通過檢測(cè)寡核苷酸完整分子或化學(xué)誘導(dǎo)裂解或者酶促裂解后得到碎裂片段的質(zhì)荷比來推斷序列。

隨著結(jié)構(gòu)表征手段的不斷豐富，尤其是對(duì)于寡核苷酸藥物關(guān)鍵質(zhì)量屬性認(rèn)知的不斷深入，必將使得建立更為規(guī)范的、更加標(biāo)準(zhǔn)化的寡核苷酸藥物結(jié)構(gòu)鑒定策略成為可能。

 

6寡核苷酸藥物含量測(cè)定方法

目前，寡核苷酸藥物含量測(cè)定的方法UV檢測(cè)或MS檢測(cè)。UV是最簡(jiǎn)單的寡核苷酸定量方法，基于寡核苷酸在260nm處的吸收光譜實(shí)現(xiàn)定性和定量分析，但一些雜質(zhì)如蛋白質(zhì)和有機(jī)物質(zhì)，在該波長(zhǎng)處也會(huì)有吸收，使結(jié)果的準(zhǔn)確性較差。

MS是寡核苷酸含量分析中十分具有前景的分析工具。由于其能夠通過相對(duì)分子量的差異分離出不同雜質(zhì)與主成分，近年來，逐漸成為寡核苷酸藥物含量測(cè)定的主要手段之一。如RENTEL等開發(fā)的IP-RPLC-UV-MS方法，對(duì)35種不同的ASO原料藥和產(chǎn)物進(jìn)行了驗(yàn)證。該方法具有良好的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性與耐用性。另外，采用內(nèi)標(biāo)MS進(jìn)行含量測(cè)定，只需幾分鐘就可實(shí)現(xiàn)基于MS的定量，能夠顯著提高了檢測(cè)效率。

 

7討論與展望

化學(xué)合成技術(shù)和藥物遞送策略的進(jìn)步促進(jìn)了寡核苷酸藥物產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。但寡核苷酸藥物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，鑒定表征難度較大，且有關(guān)物質(zhì)與寡核苷酸藥物結(jié)構(gòu)高度相似，增加了有關(guān)物質(zhì)分析的難度。此外，這類藥物的含量測(cè)定普遍采用MS技術(shù)，但目前寡核苷酸藥物MS定量的標(biāo)準(zhǔn)化方法缺失，使得這類產(chǎn)品的準(zhǔn)確定量難度較大。為了實(shí)現(xiàn)更為精準(zhǔn)的控制寡核苷酸藥物的質(zhì)量，確保該類創(chuàng)新藥產(chǎn)品的安全有效，仍然需要在以下幾個(gè)方面開展更為深入的研究。

7.1 更為精準(zhǔn)的有關(guān)物質(zhì)分析方法

寡核苷酸藥物雜質(zhì)組成復(fù)雜，尤其是PS鍵導(dǎo)致的非對(duì)映異構(gòu)體含量較多，且難以有效分離，使得這類產(chǎn)品的安全性、有效性受到了嚴(yán)重影響?；贚C-MS開展針對(duì)寡核苷酸藥物雜質(zhì)的精準(zhǔn)分析，未來極有可能成為寡核苷酸藥物產(chǎn)品質(zhì)控方法研究的重要方向。

7.2 更為精準(zhǔn)的特定雜質(zhì)質(zhì)控限度

寡核苷酸藥物作為基因治療類藥物，ASO和siRNA均為通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則發(fā)揮生物學(xué)作用，其雜質(zhì)尤其是堿基序列缺失雜質(zhì)同樣存在堿基錯(cuò)配的風(fēng)險(xiǎn)，可能產(chǎn)生脫靶毒性。因此，建議充分評(píng)估不同寡核苷酸藥物雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，制定更為合理的質(zhì)控限度。

7.3 更為全面的鑒別方法

寡核苷酸藥物的主成分與雜質(zhì)之間分離難，使得其很難通過保留時(shí)間比對(duì)產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)充分鑒別，因此需要借助MS、熱分析技術(shù)等，對(duì)產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的評(píng)判。近年來，寡核苷酸藥物的高級(jí)結(jié)構(gòu)越來越被關(guān)注，因此，未來用于表征藥物高級(jí)結(jié)構(gòu)的CD、三維NMR等技術(shù)也越來越多的用于寡核苷酸這類創(chuàng)新藥的質(zhì)量控制中。

7.4 更為精準(zhǔn)的含量測(cè)定方法研究

目前寡核苷酸藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定方法已經(jīng)越來越多采用MS進(jìn)行測(cè)定，但受限于MS重現(xiàn)性的問題，結(jié)果重現(xiàn)和轉(zhuǎn)移仍較為困難，因此，亟需開發(fā)更具通用性的基于MS的含量測(cè)定方法以及準(zhǔn)確性驗(yàn)證方法，確保寡核苷酸藥物含量的準(zhǔn)確控制。

總的來講，寡核苷酸藥物發(fā)展前景廣闊，但仍有很多方面值得深入研究。隨著技術(shù)的進(jìn)步以及研究的深入，亟需開展藥物分析、藥物毒理學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等學(xué)科與技術(shù)的交叉研究，推動(dòng)寡核苷酸藥物質(zhì)量與安全的不斷提升，讓這類創(chuàng)新產(chǎn)品更好地服務(wù)于人類生命健康。