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疏水相互作用色譜 (HIC) 是一種蛋白質(zhì)分離、純化和表征的傳統(tǒng)技術(shù)。隨著抗體偶聯(lián)藥物 (ADC) 的不斷發(fā)展，HIC 在ADC 表征和分析上應(yīng)用越來(lái)越廣泛。與其他技術(shù)不同，HIC 允許蛋白質(zhì)在保持天然結(jié)構(gòu)和活性的溫和非變性條件下進(jìn)行分析。這一點(diǎn)非常重要，為HIC后續(xù)的研究提供了條件。接下來(lái)，我們以一個(gè)傳統(tǒng)的高效液相儀配合使用硫酸銨緩沖液為例，為大家闡述HIC的關(guān)鍵參數(shù)。并對(duì)方法優(yōu)化注意事項(xiàng)進(jìn)行了總結(jié)。

 

簡(jiǎn)介

HIC的方法最早由Tiselius提出，他稱(chēng)此技術(shù)為"蛋白質(zhì)鹽析"。然而，實(shí)際的 HIC 術(shù)語(yǔ)后來(lái)由 Hjerten 創(chuàng)造，他描述此過(guò)程為在固體基質(zhì)上，蛋白質(zhì)的結(jié)合和洗脫蛋分離過(guò)程。疏水作用色譜固定相的非極性比較弱，流動(dòng)相多采用高濃度鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。溫和的分離條件，可以避免反相色譜中由于固定相較強(qiáng)的疏水性和有機(jī)流動(dòng)相引起蛋白質(zhì)的不可逆吸附和變性，因此特別適用于活性物質(zhì)的分離與純化。疏水作用色譜的固定相表面為弱疏水性基團(tuán)，它的疏水性比反相色譜用的固定相低幾十到幾百倍，而流動(dòng)相為高離子濃度的鹽溶液。蛋白質(zhì)分子在這樣的固定相和流動(dòng)相中進(jìn)行分配，蛋白質(zhì)分子上的疏水性基團(tuán)和固定相的疏水基團(tuán)作用而被保留。當(dāng)用流動(dòng)相洗脫時(shí)逐漸降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，洗脫能力增強(qiáng)。利用被分離組分分子表面的疏水微區(qū)、（可逆）變性后暴露出的疏水殘基，或在高鹽環(huán)境下暴露于分子表面的疏水殘基與固定相的疏水性配體之間的作用強(qiáng)弱，依次用從高至低離子強(qiáng)度洗脫液可將疏水作用由弱到強(qiáng)的組分分離開(kāi)。蛋白質(zhì)分子按其疏水性大小被依次洗脫出來(lái)，疏水性小的先流出。在這樣的高鹽水溶液中，蛋白質(zhì)不會(huì)失活。高濃度鹽與水分子發(fā)生強(qiáng)烈作用，導(dǎo)致疏水分子周?chē)纬煽昭ǖ乃肿訙p少，促進(jìn)疏水性分子與介質(zhì)的疏水配基之間發(fā)生結(jié)合。這種疏水作用的大小取決于固定相和溶質(zhì)的極性、流動(dòng)相的組成和濃度。由于各種蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基極性不同，因此有可能通過(guò)改變固定相的極性和流動(dòng)相的組成使蛋白質(zhì)得到分離。

圖1.HIC原理示意圖

ADC 細(xì)胞毒劑（有效載荷）必須穿過(guò)脂質(zhì)膜以抑制 DNA 復(fù)制、蛋白質(zhì)合成、酶促活動(dòng)或細(xì)胞分裂。要穿過(guò)膜，有效載荷必須是親油的，因此在性質(zhì)上是疏水的。有效載荷與抗體的連接增加了疏水性，這種變化可以通過(guò) HIC 檢測(cè)。載荷的數(shù)量與疏水性和滯留時(shí)間成正比。而且，疏水載荷越多，保留時(shí)間越長(zhǎng)。通過(guò)疏水性差異分離各藥物種類(lèi)，并對(duì)各種類(lèi)進(jìn)行定量分析，是HIC分析ADC的基礎(chǔ)。

HIC可以和RP、MS等聯(lián)用來(lái)分析ADC偶聯(lián)情況。HIC必須與MS聯(lián)用才能確認(rèn)藥物與抗體偶聯(lián)比（DAR），因?yàn)榉逯当Ａ魰r(shí)間的變化不會(huì)直接顯示藥物偶聯(lián)的程度。但是，如果每個(gè)峰的偶聯(lián)情況確定了，HIC可以很快并準(zhǔn)確確定每種藥物的比率。因此，HIC用于質(zhì)量評(píng)價(jià)和反應(yīng)監(jiān)測(cè)的主要方法，由于分離過(guò)程的溫和性，可以用于分析具有酸不穩(wěn)定連接的ADC。

HIC分析也用于候選藥物的選擇，以盡量減少由于非特異性相互作用而引起的體外和體內(nèi)毒性。疏水分子往往更容易通過(guò)非特異性結(jié)合與細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層結(jié)合，并可能導(dǎo)致不必要的毒性。在HIC分析中，由于疏水性與保留時(shí)間成正比，因此通常根據(jù)保留時(shí)間和疏水性對(duì)藥物進(jìn)行篩選。ADC候選藥物的選擇主要考慮療效和HIC疏水性?xún)A向等指標(biāo)。

使用Tris-HCl為基礎(chǔ)的緩沖液以線性梯度從色譜柱中洗脫蛋白質(zhì)，有利于不同疏水物質(zhì)的分離。DAR是通過(guò)比較每個(gè)峰值的相對(duì)量和載荷的共軛程度來(lái)確定的（通過(guò)峰面積百分比和偶聯(lián)藥物個(gè)數(shù)計(jì)算加權(quán)平均DAR）。與用于ADC分析和表征的其他技術(shù)相比，HIC提供了一種獨(dú)特、快速的分析方法，具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。如質(zhì)譜、反相和親水性相互作用色譜(HILIC)依賴(lài)有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相，低或高pH值，高溫等，都有可能使ADC變性。而且針對(duì)ADC來(lái)優(yōu)化這些方法從而解決這些問(wèn)題又是非常耗時(shí)的。HIC分離得到的ADC組分保持活性，可用于療效研究。HIC不能應(yīng)用于一些親水載荷。而且，非常疏水的有效載荷可能需要大量的方法開(kāi)發(fā)。HIC必須與質(zhì)譜相聯(lián)才能進(jìn)行各峰的鑒定，才能準(zhǔn)確計(jì)算DAR，否則，就必須對(duì)藥物負(fù)荷峰值進(jìn)行假設(shè)。對(duì)于ADC的疏水性排序，HIC分析是最合適的，因?yàn)橹Y(jié)合是由蛋白質(zhì)的疏水性驅(qū)動(dòng)的，而疏水性與保留時(shí)間成正比。HIC方法的優(yōu)化沒(méi)有通用的規(guī)則，針對(duì)不同的樣品有不同的方法。本文所描述的方法利用常用的硫酸銨緩沖體系和丁基柱對(duì)ADC進(jìn)行表征、排序和分析，是開(kāi)發(fā)優(yōu)化HIC方法基礎(chǔ)。

下面以一個(gè)具體的例子為大家詳細(xì)闡述HIC在ADC上的應(yīng)用。此方法可以套用與不同的ADC，同時(shí)，也可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。

 

材料

在制備和處理ADC樣品時(shí)，應(yīng)注意個(gè)人防護(hù)，建議使用雙丁腈手套和袖護(hù)套，以防止暴露。試劑均為液相色譜級(jí)。所有設(shè)備和消耗品都有適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽，以傳達(dá)潛在的危險(xiǎn)。

 

緩沖液

流動(dòng)相A: 25mm Tris-HCl, 1.5M硫酸銨，pH 8.0

稱(chēng)取198.2 g硫酸銨，加700ml超純水溶解，加入25 mL 1 M Tris HCl(pH8.0)，用0.1 M氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8.0。用超純水定容至1L，0.2μM濾膜過(guò)濾。

流動(dòng)相B: 25mm Tris-HCl(pH8.0)，5%異丙醇

取25ml 1MTris HCl(pH8.0)于燒杯中，加925ml超純水和50ml的異丙醇。0.2μM濾膜過(guò)濾。

 

色譜柱

無(wú)孔TSKgel Butyl-NPR色譜柱（TOSOH Bioscience）:4.6 μm ID *3.5 cm, 粒徑2.5μM。

 

樣品準(zhǔn)備

抗體和ADC用1x PBS pH 7.2 稀釋至1 mg/mL ，0.2 μM濾頭過(guò)濾。

 

設(shè)備

安捷倫1290 Infinity UHPLC，四元泵，1200系列高性能自動(dòng)采樣器，二極管陣列檢測(cè)器，分?jǐn)?shù)收集器，Open Lab軟件。

 

方法

1.在280nm和214nm處讀取吸光度，峰值寬度為0.2分鐘(4 s響應(yīng)時(shí)間)(1.25 Hz)；

2.0.8ml/min，室溫，進(jìn)樣量50ug；

3.流動(dòng)相梯度如下：

積分事件表

 

數(shù)據(jù)處理

圖2.HIC分析ADC的典型圖譜。(a)完整的色譜圖，有溶劑峰、洗脫峰和由于硫酸銨緩沖液導(dǎo)致的基線偏移。(b)放大顯示峰形的色譜圖

圖3和圖4為隨機(jī)偶聯(lián)和定點(diǎn)偶聯(lián)圖譜，DAR是通過(guò)比較每個(gè)峰值的相對(duì)量和載荷的共軛程度來(lái)確定的（通過(guò)峰面積百分比和偶聯(lián)藥物個(gè)數(shù)計(jì)算加權(quán)平均DAR）。

圖3.鉸鏈半胱氨酸隨機(jī)偶聯(lián)ADC的HIC圖譜。ADC(紅色)和未偶聯(lián)抗體(藍(lán)色)。每個(gè)峰的藥物載量由星星的數(shù)量表示。

圖4.半胱氨酸位點(diǎn)特異性偶聯(lián)ADC的HIC圖譜。ADC(紅色)和未偶聯(lián)抗體(藍(lán)色)。每個(gè)峰的藥物載量由星星的數(shù)量表示。平均每個(gè)抗體的DAR為3.8個(gè)藥物。

以下圖5為例具體計(jì)算DAR值

圖5.每個(gè)峰的面積百分比及對(duì)應(yīng)的DAR值

大家可以參考上述HIC分析ADC的方法，對(duì)ADC的疏水性、DAR值等進(jìn)行表征，以上面的方法為基礎(chǔ)，通過(guò)優(yōu)化方法，開(kāi)發(fā)出適合自己產(chǎn)品的方法。

下面為大家總結(jié)一些HIC在ADC分析表征應(yīng)用中需要注意的問(wèn)題。干貨，強(qiáng)烈建議收藏。有問(wèn)題也可以隨時(shí)私信小編，我們一起探討。

1.注意硫酸銨的儲(chǔ)存及使用有效期，一般室溫密閉條件下可以保存1個(gè)月。用時(shí)用0.2um濾膜過(guò)濾，注意觀察是否有結(jié)晶析出。

2.有效載荷在本質(zhì)上是疏水性的。疏水性越強(qiáng)，保持時(shí)間越長(zhǎng)。非常疏水的有效載荷可能會(huì)影響ADC峰的形狀和洗脫，可能需要有機(jī)修飾劑來(lái)實(shí)現(xiàn)完全柱洗脫。對(duì)于疏水性非常強(qiáng)的載荷，當(dāng)優(yōu)化HIC方法時(shí)，應(yīng)考慮非支鏈和較短側(cè)鏈的色譜柱。

3.提高流動(dòng)相緩沖液的pH值有助于提高抗體和ADC的柱結(jié)合，而降低pH有助于蛋白質(zhì)的洗脫。大多數(shù)抗體的等電點(diǎn)在7和9之間。因此，當(dāng)緩沖液的pH值接近pI時(shí)，會(huì)減少凈表面電荷，并可能促進(jìn)與柱的相互作用。相反，降低緩沖液的pH值，遠(yuǎn)離pI，將增加凈表面電荷，可能有助于蛋白質(zhì)洗脫。然而，緩沖液pH值的變化對(duì)ADC結(jié)合和洗脫的影響是不可預(yù)測(cè)的，取決于樹(shù)脂類(lèi)型、緩沖鹽和樣品。

4.不與HIC柱結(jié)合的樣品會(huì)流穿，與溶劑峰一起洗脫，導(dǎo)致溶劑峰強(qiáng)度增加。將硫酸銨濃度提高到2 M，并將pH值調(diào)整到更接近ADC pI的位置是改善結(jié)合的策略。然而，對(duì)于某些adc來(lái)說(shuō)，色譜柱可能就需要具有更長(zhǎng)的鏈或更多非極性基團(tuán)。

5.HIC一般不會(huì)出現(xiàn)回收率差的問(wèn)題。ADC沒(méi)有注入到HIC色譜柱經(jīng)常會(huì)被誤解為沒(méi)有從色譜柱洗脫，而實(shí)際上是由于ADC從一開(kāi)始就沒(méi)有進(jìn)入到色譜柱上。因此，重要的是要驗(yàn)證ADC是否吸附在色譜柱，以及儀器是否正常工作。同時(shí)，確保溶劑峰值強(qiáng)度不升高。當(dāng)ADC不能洗脫時(shí)，可在流動(dòng)相B中加入有機(jī)改進(jìn)劑，如異丙醇或乙腈（15%，v/v），以促進(jìn)ADC從柱基質(zhì)中釋放，然而，應(yīng)避免蛋白鹽析或者變性。在流動(dòng)相aA中不應(yīng)使用有機(jī)修飾劑。這些修飾劑通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)與色譜柱的結(jié)合，并通過(guò)增加流動(dòng)相的表面張力來(lái)幫助洗脫蛋白，從而減少疏水相互作用。因此，向流動(dòng)A中添加修飾劑會(huì)增加蛋白不與色譜柱結(jié)合的可能性。如果使用其他色譜柱，首先確保未偶聯(lián)的抗體結(jié)合并在梯度25%以前被洗脫。

6.經(jīng)典共軛ADC的一般方法通常無(wú)法實(shí)現(xiàn)峰基線分離;而對(duì)于更均勻的位點(diǎn)特異性共軛ADC，則得到了較好的結(jié)果，分別見(jiàn)圖3和圖4。為了達(dá)到良好的峰分離，需要對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化需要考慮流速、梯度、HIC柱和流動(dòng)相組成。由于分子的復(fù)雜性，優(yōu)化HIC方法通常與未偶聯(lián)ADC有一定差異。

7.峰的分離是數(shù)據(jù)分析中需要檢查的另一個(gè)重要參數(shù)。預(yù)期峰的數(shù)量應(yīng)該反映在圖譜中。缺少峰值或增加峰值對(duì)DAR計(jì)算都是有影響的。因此，質(zhì)譜分析需要突出偶聯(lián)藥物的數(shù)量和每個(gè)峰的載藥量，以確定峰分離方法的充分性。當(dāng)考慮到這一點(diǎn)時(shí)，可以通過(guò)延長(zhǎng)梯度來(lái)改善峰分離。

8.梯度優(yōu)化可以改善峰的形狀和峰的分離，以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。一般來(lái)說(shuō)，增加梯度的長(zhǎng)度可以改善峰的分離和形狀。由于ADC的復(fù)雜性，梯度優(yōu)化參數(shù)必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。梯度選擇依賴(lài)于流動(dòng)相、流速和色譜柱。使用硫酸銨緩沖液的洗脫梯度較短，但使用其他緩沖鹽時(shí)必須延長(zhǎng)梯度。

9.丁基樹(shù)脂是HIC柱最廣泛使用的樹(shù)脂，由于樹(shù)脂鏈長(zhǎng)，具有中等的結(jié)合傾向。典型的HIC柱具有線性的烷烴鏈或簡(jiǎn)單的芳香基團(tuán)，并可以通過(guò)分支進(jìn)一步修飾。不同廠家的丁基色譜柱可能會(huì)有不同的差異，從而影響結(jié)合、峰分離和洗脫。使用具有更長(zhǎng)或更多支鏈的色譜柱可以增強(qiáng)樣品的結(jié)合和保留。樹(shù)脂的結(jié)合能力取決于鏈的長(zhǎng)度，鏈越短，結(jié)合能力越弱，反之亦然。一些常見(jiàn)的樹(shù)脂，按鏈長(zhǎng)從低到高和結(jié)合能力的順序?yàn)?甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。

10.樣品純度是HIC分析成功的關(guān)鍵。所有樣本都應(yīng)過(guò)濾，去除游離載荷和聚合，以確保獲得準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。對(duì)于小規(guī)模的偶聯(lián)物，ADC可以使用緩沖交換柱進(jìn)行純化;對(duì)于大規(guī)模的制劑，ADC可以使用陶粒羥基磷灰石色譜或切向流過(guò)濾進(jìn)行純化，以去除或最小化自由載荷污染物和聚集物。自由載荷，特別是那些非常疏水的載荷，也會(huì)與HIC柱結(jié)合，這可能會(huì)使數(shù)據(jù)解釋復(fù)雜化(如圖6所示)。蛋白質(zhì)聚集物往往更疏水，并將與單體分離，從而形成單獨(dú)的峰。由于峰的識(shí)別對(duì)于準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)解釋至關(guān)重要，所以應(yīng)該盡一切努力消除由于聚集物和游離藥物等人為因素造成的峰。

圖6.ADC自由載荷去除前后的HIC色譜圖。藍(lán)色比較未偶聯(lián)抗體，紅色表示ADC自由載荷去除前，綠色表示ADC自由載荷去除后。

11.進(jìn)樣體積請(qǐng)勿超過(guò)100 μL，否則ADC可能無(wú)法與柱結(jié)合。該方法旨在最小化樣品制備。如果進(jìn)樣體積大，則樣品緩沖界面的鹽濃度過(guò)低，導(dǎo)致ADC不會(huì)被柱吸附。為了克服這個(gè)問(wèn)題，可以在樣品中加入體積比不超過(guò)50%的流動(dòng)相A。同時(shí)要避免流動(dòng)相A直接加入到樣品中可能引起蛋白沉淀。

12.注意溶劑峰的保留時(shí)間，如果保留時(shí)間有漂移，可能是鹽的沉積堵塞管路，需清洗設(shè)備。記錄柱安裝后的初始儀表背壓。背壓的增加會(huì)影響結(jié)果。在樣品運(yùn)行前后，用50毫升水沖洗HPLC，清除儀器上的殘留鹽，以防止堵塞或限制流動(dòng)。銨鹽可能在儀器內(nèi)沉淀，導(dǎo)致樣品結(jié)合和回收率差、保留時(shí)間偏移、樣品洗脫不完全，影響方法優(yōu)化、數(shù)據(jù)解釋和故障排除。

13.柱溫對(duì)樣品的吸附和洗脫影響很小，但會(huì)影響峰型。柱溫最好不要超過(guò)30℃，否則會(huì)使蛋白變性。柱溫優(yōu)化應(yīng)該放在最后。

14.在A280nm處監(jiān)測(cè)洗脫峰時(shí)，硫酸銨緩沖液通過(guò)梯度洗脫會(huì)導(dǎo)致基線輕微偏移。然而，可以使用使信號(hào)與噪聲之比最大化的任何吸收波長(zhǎng)。在某些情況下，附加有效載荷后，可以在一個(gè)特有的波長(zhǎng)下區(qū)分共軛峰與非共軛峰。例如，在330 nm下對(duì)吡咯苯并二氮雜卓偶聯(lián)ADC進(jìn)行檢測(cè)，只能檢測(cè)到偶聯(lián)的峰。

15.峰的積分是DAR計(jì)算的必要條件，良好的峰形對(duì)計(jì)算精度有重要意義。峰值形狀主要受色譜柱和梯度的影響。如果峰太寬或太窄，峰的準(zhǔn)確積分會(huì)受到影響。延長(zhǎng)梯度可以改善窄峰的形狀，縮短梯度有助于寬峰的形狀。只有為了保證積分精度，才能改變峰的形狀。改變流動(dòng)相組成，例如，使用乙酸銨緩沖液或不同的色譜柱，可能會(huì)改善峰型。

16.具有非疏水或親水載荷的adc可能不具有典型的洗脫峰。這些ADC能以較短的保留時(shí)間洗脫或與裸抗共洗脫，如果ADC和未偶聯(lián)抗體保留時(shí)間相同，則不能使用HIC進(jìn)行分析和表征。

17.共軛位點(diǎn)影響峰的形狀和洗脫峰的數(shù)量。迄今為止，所有已批準(zhǔn)的ADC均使用賴(lài)氨酸或鉸鏈半胱氨酸的隨機(jī)偶聯(lián)方法。這種偶聯(lián)方法產(chǎn)生多個(gè)峰，對(duì)應(yīng)于藥物負(fù)載的程度，分析起來(lái)可能很復(fù)雜(圖2)。另外，臨床試驗(yàn)中的幾個(gè)ADC是位點(diǎn)特異性偶聯(lián)到一個(gè)或多個(gè)工程位點(diǎn)。這些位點(diǎn)特異性ADC一般都是均勻的，用HIC分析時(shí)產(chǎn)生一個(gè)單峰，比隨機(jī)共軛的adc疏水性更低。與隨機(jī)偶聯(lián)的ADC相比，一些位點(diǎn)特異性的偶聯(lián)位點(diǎn)可以最大限度地減少負(fù)載的暴露，從而減少疏水性和保留時(shí)間。

18.記錄初始溶劑峰值強(qiáng)度。溶劑峰強(qiáng)度的增加表明樣品結(jié)合不完全。溶劑峰強(qiáng)度對(duì)排除ADC結(jié)合問(wèn)題非常有用。在方法優(yōu)化過(guò)程中，當(dāng)測(cè)試柱或流動(dòng)相時(shí)，跟蹤溶劑峰值強(qiáng)度是非常有用的。

 

 

圖7.種裸抗ADC的疏水性排序HIC圖譜?？贵wF疏水性最小，抗體C疏水性最強(qiáng)

19.在對(duì)抗體和ADC進(jìn)行疏水性排序時(shí)，應(yīng)具有合適大的樣品濃度和緩沖液。由于疏水性和脫靶毒性之間的聯(lián)系，基于疏水性的藥物候選排序是重要的。圖7顯示了針對(duì)相同腫瘤特異性抗原的6個(gè)抗體的HIC分析，這些抗體是ADC候選藥物。在這種情況下，mAb-A疏水性最小。在對(duì)ADC進(jìn)行疏水性排名分析時(shí)，抗體、偶聯(lián)位點(diǎn)、偶聯(lián)方法和負(fù)載都會(huì)影響保留時(shí)間。

以上內(nèi)容就是HIC在ADC分析表征中的應(yīng)用，同時(shí)總結(jié)了一些注意事項(xiàng)以供大家參考。由于ADC結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，很難找到一個(gè)通用的HIC方法應(yīng)用與所有的ADC表征分析。但是，大家可以借鑒本文提供的特例及研究思路，優(yōu)化出一款適合自己ADC產(chǎn)品分析表征的HIC方法。
 

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