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摘 要： 利用高效液相色譜法測定Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗中2-苯氧乙醇含量，對測定結(jié)果的不確定度進行評定。根據(jù)測量過程建立數(shù)學(xué)模型，對Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗中2-苯氧乙醇含量測定過程中不確定度來源進行分析，計算合成相對標準不確定度和擴展不確定度。2-苯氧乙醇的質(zhì)量濃度在0.2～0.8 mg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗中2-苯氧乙醇質(zhì)量濃度表示為（4.70±0.40） mg/mL（k=2，置信水平為95%）。高效液相色譜法測定Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗中2-苯氧乙醇的不確定度主要來源于標準溶液配制、樣品溶液稀釋、標準曲線擬合、樣品重復(fù)測量等過程，其中標準溶液配制和樣品溶液稀釋過程對測定結(jié)果的不確定度貢獻較大，在實驗過程中應(yīng)予以重點控制。

 

關(guān)鍵詞： Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗； 高效液相色譜法； 2-苯氧乙醇； 不確定度

 

2-苯氧乙醇可以有效抵抗多種細菌和酵母菌等微生物污染，作為一種廣譜抗菌劑廣泛應(yīng)用于化妝品和甲肝滅活疫苗、吸附無細胞百白破聯(lián)合疫苗、Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗等多種產(chǎn)品的生產(chǎn)中[1?5]，其中抗菌劑是影響產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素，因此，保證疫苗中2-苯氧乙醇的含量尤為重要。

測量不確定度是測量科學(xué)中的一個重要概念，通過對測量結(jié)果進行定量表征，可以反映測量結(jié)果可信程度，降低檢測結(jié)果接近限值時的誤判風(fēng)險[6?9]。作為評價測量結(jié)果質(zhì)量的參數(shù)，測量不確定度已被國際社會普遍接受，并已廣泛應(yīng)用于眾多檢測領(lǐng)域[10?14]。通過不確定度的分析，實驗人員可以對檢測結(jié)果有更加準確的判斷，同時，通過控制或消除對測量結(jié)果影響較大的因素，可不斷提高測量結(jié)果的精度與可信程度[15?17]?！吨腥A人民共和國藥典》(2020版)中關(guān)于Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗中2-苯氧乙醇含量的測定采用單點校正法[18]，該方法定量誤差范圍較大，難以滿足高精度檢測要求。為了提高測量的準確性與可靠性，筆者建立了sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗中2-苯氧乙醇含量測定的高效液相色譜(HPLC)法，明確了該方法的線性范圍，以減少定量誤差。根據(jù)CNAS-CL01-G003：2021《測量不確定度的要求》和CNAS-CL01：2018《檢測和校準實驗室能力的通用要求》，開展檢測和校準的實驗室應(yīng)評定測量結(jié)果的不確定度[19]。筆者基于JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，建立測量不確定度的數(shù)學(xué)模型，對測定過程中的影響因素進行了識別和量化，旨在為提高Sabin株脊髓灰質(zhì)炎疫苗中2-苯氧乙醇含量測定結(jié)果的精度提供一種可靠的方法，促進2-苯氧乙醇含量測定方法的標準化和規(guī)范化。

 

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 Infinity Ⅱ 型，配置二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技有限公司。分析天平：QUINTIX224-1CN型，感量為0.1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(Vero細胞)：規(guī)格為0.5 mL/瓶，批號為202107042Q，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所。2-苯氧乙醇標準品：質(zhì)量分數(shù)為99.1%，批號為190242-202001，中國食品藥品檢定研究院。乙腈：色譜純，德國默克公司。無水乙醇：分析純，四川西隴科學(xué)有限公司。實驗用水為純凈水。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：CAPCELL PAK柱(250 mm×4.6 mm，5 µm，日本株式會社大阪曹達)；流動相：乙腈-純水(體積比為1∶1)，流量為1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣體積：5 µL；檢測波長：270 nm。

1.3 實驗步驟

1.3.1 溶液配制2-苯氧乙醇標準儲備溶液：稱取2-苯氧乙醇標準品100 mg (精確到0.000 1 g)至10 mL容量瓶中，加入適量50% (體積分數(shù)，下同)乙醇溶液溶解，渦旋混勻，加入50%乙醇溶液定容至標線，作為標準儲備溶液。2-苯氧乙醇系列標準工作溶液：分別取2-苯氧乙醇標準儲備溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容至標線，得到質(zhì)量濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 mg/mL的系列標準工作溶液。測定前經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。1.3.2 樣品處理取Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗，混勻，用1 mL移液器吸取1 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙醇溶液定容至標線。測定前經(jīng)0.22 μm濾膜過濾。以50%乙醇溶液作為空白溶液。1.3.3 樣品測定根據(jù)1.2儀器工作條件，測定2-苯氧乙醇系列標準工作溶液，以2-苯氧乙醇的質(zhì)量濃度為橫坐標，以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。以同樣儀器工作條件，測定空白溶液和樣品溶液，根據(jù)標準工作曲線計算樣品中2-苯氧乙醇的質(zhì)量濃度。

 

2 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)樣品檢測過程，建立2-苯氧乙醇含量測定的不確定度評估數(shù)學(xué)模型，按式(1)計算樣品中2-苯氧乙醇的質(zhì)量濃度：

ρx=ρ0×M

(1)

式中：ρx——樣品中2-苯氧乙醇的質(zhì)量濃度，mg/mL；ρ0——利用標準曲線計算的樣品溶液中2-苯 氧乙醇的質(zhì)量濃度，mg/mL；M——樣品稀釋倍數(shù)。

 

3 不確定度來源

根據(jù)測定過程和數(shù)學(xué)模型，樣品中2-苯氧乙醇測定結(jié)果的不確定度主要來源于： (1)樣品稀釋過程引入的不確定度，包括樣品移取、樣品溶液定容；(2)標準溶液配制過程引入的不確定度，包括標準品純度、標準品稱量、標準溶液定容；(3)標準曲線擬合引入的不確定度；(4)樣品重復(fù)測量引入的不確定度。

 

4 不確定度的評定

4.1 樣品稀釋引入的相對標準不確定度urel(V)

樣品稀釋過程中使用10 mL 容量瓶和1 mL移液器，其不確定度主要來自于容量允差和環(huán)境溫度變化。根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器》檢定規(guī)程以及JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》，10 mL容量瓶的容量允差為±0.02 mL，1 mL移液器的最大允許誤差為±0.01 mL。按照矩形分布，k=，則量器的最大允許誤差引入的相對標準不確定度按式(2)計算：

urel(V1) =

(2)

式中：a1——量器的最大允許誤差，mL；V——量器的容量，mL。查得乙醇和水的體積膨脹系數(shù)分別為1.09×10-3 ℃-1和2.1×10-4 ℃-1[15,20]，定容溶液為50%乙醇溶液，實驗室溫度為(20±3) ℃，按照均勻分布，k=，則溫度變化引入的相對標準不確定度按式(3)計算：

urel(V2) =

(3)

式中：aT——溫度變化引起的體積偏差，mL。樣品稀釋過程中10 mL 容量瓶和1 mL移液器引入的不確定度見表1。

表1   樣品稀釋過程中玻璃量器引入不確定度

Tab. 1   Uncertainty introduced by glass measuring instruments during sample dilution process

 

則樣品稀釋引入的相對標準不確定度：urel(V)==0.006 1

4.2 標準溶液配制引入的相對標準不確定度urel(ρ)

4.2.1 標準品純度引入的相對標準不確定度urel(w)依據(jù)2-苯氧乙醇標準品證書，2-苯氧乙醇的質(zhì)量分數(shù)w=99.1%，擴展不確定度Us=0.5%，按照矩形分布，k=，則標準品純度引入的相對標準不確定度：urel(w)==0.002 9134.2.2 標準品稱量引入的相對標準不確定度urel(m)標準品稱量用天平感量為0.1 mg，其最大允許誤差為±0.5 mg，按照矩形分布，k=，則天平稱量允差引入的標準不確定度：u(m1)=0.5/k=0.288 7 mg2-苯氧乙醇標準品稱量采用減重法，合計稱量2次，稱量質(zhì)量m=109.485 4 g，因此標準品稱量引入的相對標準不確定度：urel(m)==0.001 8644.2.3 標準溶液定容用玻璃量器引入的相對標準不確定度urel(Vs)標準溶液定容過程中使用10 mL容量瓶7次，1 mL移液器6次，其不確定度主要來自于容量允差和環(huán)境溫度變化。標準溶液定容過程中10 mL容量瓶和1 mL移液器引入的不確定度見表2。

表2   標準溶液定容過程中玻璃量器引入的不確定度

Tab. 2   Uncertainty introduced by glass measuring instruments during the preparation process of standard solutions

 

根據(jù)表2數(shù)據(jù)，10 mL容量瓶使用7次的合成相對標準不確定度urel(V10)=0.004 267，1 mL移液器使用6次的合成相對標準不確定度urel(Vp)=0.041 20。則標準溶液定容引入的相對標準不確定度：urel(Vs)==0.041 42合成上述各不確定度分量，得到標準溶液配制引入的相對標準不確定度：urel(ρ)==0.041 57

4.3 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(L)

2-苯氧乙醇系列標準溶液共有6種不同的質(zhì)量濃度，各質(zhì)量濃度分別測定3次，得到色譜峰面積平均值，結(jié)果見表3。

表3   系列標準工作溶液測定結(jié)果

Tab. 3   Determination results of series standard working solution

以標準溶液的質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標，以色譜峰面積平均值(y)為縱坐標，利用最小二乘法進行線性擬合，得線性方程為y=3 120.2ρ-76.26，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。由標準工作曲線計算得樣品溶液中2-苯氧乙醇的質(zhì)量濃度ρ0=0.47 mg/mL。標準曲線擬合過程中殘差標準差sR和標準曲線擬合引入的標準不確定度u(L)分別按式(4)和式(5)計算：

sR=

(4)

 

u(L)=

(5)

式中：a——標準曲線斜率；b——標準曲線截距；n——標準曲線各質(zhì)量濃度點測量總次數(shù)，n=18；p——樣品溶液的平行測量次數(shù)，p=3；ρ0——樣品溶液中2-苯氧乙醇的平均質(zhì)量濃度，mg/mL；——系列標準溶液的平均質(zhì)量濃度，mg/mL；ρi——第i次測定的標準溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；yi——第i次測定的標準溶液色譜峰面積。將相關(guān)數(shù)據(jù)代入式(4)和式(5)，計算得標準曲線擬合引入的標準不確定度：u(L)=0.002 424 mg/mL樣品溶液中2-苯氧乙醇的質(zhì)量濃度ρ0為0.47 mg/mL，則由標準曲線擬合引入的相對標準不確定度：urel(L)=u(L)/ρ0=0.005 157

4.4 樣品重復(fù)測量引入的相對標準不確定度urel(R)

樣品重復(fù)測定6次，樣品中2-苯氧乙醇的質(zhì)量濃度分別為4.72、4.70、4.71、4.71、4.69、4.69 mg/mL，平均值ρx為4.70 mg/mL，標準偏差s按式(6)計算：

s=

(6)

式中：j——樣品測量次數(shù)，j=6；ρix——第i次測得的2-苯氧乙醇的質(zhì)量濃度，mg/mL；ρx——6次測得的2-苯氧乙醇質(zhì)量濃度平均值，mg/mL。計算得標準偏差s=0.005 416 mg/mL，樣品6次重復(fù)測量的標準不確定度：u(R)==0.002 211 mg/mL相對標準不確定度：urel(R)=u(R)/ρx=0.000 47

4.5 合成相對標準不確定度urel

各相對標準不確定度分量分析結(jié)果見表4。各不確定度分量彼此獨立不相關(guān)，對各不確定度分量進行合成得相對標準不確定度：

表4   不確定度分量排序

Tab.4   Sorting of uncertainty components

 

urel==0.042 33

4.6 擴展不確定度

樣品中2-苯氧乙醇質(zhì)量濃度ρx=4.70 mg/mL，取包含因子k=2 (置信概率為95%)，則樣品中2-苯氧乙醇質(zhì)量濃度的擴展不確定度：U=ρx×urel×k=0.40 mg/mL高效液相色譜法測定Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗中2-苯氧乙醇含量(質(zhì)量濃度)結(jié)果可表示為(4.70±0.40) mg/mL (k=2，置信概率為95%)。

 

5 結(jié)語

采用高效液相色譜法測定Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗中2-苯氧乙醇含量，分析了測定過程中不確定度的來源。2-苯氧乙醇的質(zhì)量濃度在0.2～0.8 mg/mL范圍內(nèi)與與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。測定結(jié)果的不確定度主要來源于樣品稀釋、標準溶液配制、標準曲線擬合、重復(fù)測量等過程，其中標準溶液配制過程對測定結(jié)果影響最大，其次為樣品稀釋過程。當(dāng)樣品中2-苯氧乙醇的質(zhì)量濃度為4.70 mg/mL時，其擴展不確定度為0.40 mg/mL，測定結(jié)果可表示為(4.70±0.40) mg/mL (k=2，置信概率為95%)。通過使用允差小的定容器具，控制環(huán)境溫度變化，定期開展儀器設(shè)備校準，可以降低測量過程的不確定度，進一步提高檢測結(jié)果的準確性和可靠性。

 

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