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《中國藥典》2025版新增了通則1109 洋蔥伯克霍爾德菌群檢查法，來對藥品或環(huán)境中的洋蔥伯克霍爾德菌群的檢驗方法進(jìn)行規(guī)定。下文中，對洋蔥伯克霍爾德菌群進(jìn)行介紹、了解其生長特性，在哪些情況下較易存在，以及根據(jù)《中國藥典》的相關(guān)要求，應(yīng)該如何對其進(jìn)行檢測。

1. 洋蔥伯克霍爾德菌群的介紹

洋蔥伯克霍爾德菌群（Burkholderia cepacia complex，Bcc）是由多個基因型高度相似、表型相近的洋蔥伯克霍爾德菌種組成的“復(fù)合菌群”，菌種與菌種之間通常無法通過表型進(jìn)行區(qū)分，只能通過基因型進(jìn)行辨別。

該菌群是常見于水和土壤當(dāng)中的細(xì)菌，屬于不可接受微生物，具有高致病性，且對多種抗生素均有耐藥性，對于免疫力低下的人群比較危險。癥狀因人而異，輕者可無癥狀，重者可出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸道感染（尤其是囊性纖維化或其他慢性肺病患者）。其他常見的病理反應(yīng)常見發(fā)熱和乏力?？赡艿膫鞑ネ緩街饕幸韵聨追N：

•環(huán)境暴露：接觸受污染的水體、土壤或其他液態(tài)環(huán)境
•物體表面?zhèn)鞑ィ航佑|被污染的物體表面
•醫(yī)療器械傳播：使用被污染的醫(yī)療設(shè)備
•人際傳播：多見于囊性纖維化患者之間的接觸傳播

該菌群屬于革蘭氏陰性菌，單個或成對排列，不產(chǎn)生芽孢（革蘭氏陰性菌均不產(chǎn)生），有運動性，最適宜生長溫度是30-35℃，4℃下不生長，屬于需氧菌，為非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌[1]。

2. 需要檢測洋蔥伯克霍爾德菌群的情況

因為該細(xì)菌為在低營養(yǎng)物質(zhì)中容易存活的細(xì)菌，易分布在水或其他液體環(huán)境中，故需要定期在水系統(tǒng)中進(jìn)行檢測。對于水分活度高的制劑（如：溶液劑、混懸劑、洗劑、乳膏劑、軟膏劑和凝膠劑等），通常情況下，水分活度高于0.84的非無菌制劑中，也需要進(jìn)行考察。除此之外，USP還規(guī)定需要對吸入制劑、口腔黏膜、皮膚和鼻用等非無菌藥品也要重點關(guān)注。

3. 洋蔥伯克霍爾德菌群的檢測方法

3.1 培養(yǎng)基適用性檢查

洋蔥伯克霍爾德菌群選擇性瓊脂培養(yǎng)基需要進(jìn)行培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力和指示特性的檢查。每批次的培養(yǎng)基（商品化預(yù)制培的、按照處方配制的或者由脫水培養(yǎng)基配制的）均需進(jìn)行。

陰性對照試驗：陰性對照試驗應(yīng)該沒有細(xì)菌生長（用稀釋劑代替菌株，進(jìn)行培養(yǎng)）。

培養(yǎng)基促生長能力檢查：用涂布法分別接種不大于100cfu的洋蔥伯克霍爾德菌、新洋蔥伯克霍爾德菌和神秘伯克霍爾德菌（傳代次數(shù)均不超過5代），接種于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，檢查在規(guī)定的培養(yǎng)溫度并且小于等于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，各試驗菌株在被檢培養(yǎng)基上與對照培養(yǎng)基上生長的形態(tài)特征、菌落大小均應(yīng)一致。

培養(yǎng)基抑制能力檢查：接種不少于100cfu的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌于被檢培養(yǎng)基上，在檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及大于等于規(guī)定的最長時間下培養(yǎng)，各試驗菌應(yīng)不得生長。（證明培養(yǎng)基的選擇性）

培養(yǎng)基指示特性檢查：用涂布法分別接種不大于100cfu的洋蔥伯克霍爾德菌、新洋蔥伯克霍爾德菌和神秘伯克霍爾德菌，接種于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，檢查在規(guī)定的培養(yǎng)時間范圍及規(guī)定的培養(yǎng)溫度內(nèi)培養(yǎng)，各試驗菌株在被檢培養(yǎng)基上與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征、與指示劑的反應(yīng)情況等均應(yīng)該是一致的。

3.2 檢查方法適用性試驗

供試液制備：取供試品，用適宜的方法和稀釋劑制成1:10供試液（可以參考中國藥典1105通則項下供試液的制備方法）。

適用性試驗：取相當(dāng)于1g、1ml 、1 貼或10cm2的供試液和不大于100cfu的試驗菌（洋蔥伯克霍爾德菌、新洋蔥伯克霍爾德菌和神秘伯克霍爾德菌）接種至規(guī)定的培養(yǎng)基（胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或洋蔥伯克霍爾德菌群選擇性瓊脂培養(yǎng)基）中，按照檢查方法，在規(guī)定的溫度和最短時間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。

如果是采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液、過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌，過濾，注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接種至規(guī)定的培養(yǎng)基中，然后進(jìn)行檢查。

結(jié)果判斷：各種試驗菌在上述實驗中被檢出，按此供試液制備方法和檢查方法進(jìn)行供試品檢查；若未檢出任一試驗菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性（加中和劑、滅活劑、擴(kuò)大培養(yǎng)基體積、如果是薄膜過濾法的話，還可以適當(dāng)增加沖洗液的體積），并重新進(jìn)行方法適用性試驗。

如經(jīng)過各種試驗確認(rèn)供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認(rèn)為洋蔥伯克霍爾德菌群不容易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查，在這種情況下，應(yīng)該進(jìn)行風(fēng)險評估（根據(jù)生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品特性、原輔料的微生物污染情況進(jìn)行、產(chǎn)品水分活度等進(jìn)行），以保證檢驗方法的可靠性，保證產(chǎn)品質(zhì)量。

3.3 供試品檢查（采用經(jīng)方法適用性試驗確認(rèn)的方法進(jìn)行檢驗）

陽性對照試驗：陽性對照試驗方法同供試品的洋蔥伯克霍爾德菌群檢查，對照均的加量應(yīng)不大于100cfu。選擇1株試驗菌作為陽性對照菌株，應(yīng)該檢出相應(yīng)的試驗菌。陽性對照無需每批檢測，根據(jù)評估確定日常檢驗過程中陽性對照試驗的必要性、頻次及其他要求即可。試驗菌株在通過方法適用性試驗的3種菌株中任選一株即可。

陰性對照試驗：以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)檢查法檢查，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。如果有的話，應(yīng)進(jìn)行調(diào)查。

供試液制備和增菌培養(yǎng)：取供試品，用適宜的方法和稀釋劑制成1:10供試液（可以參考中國藥典1105通則項下供試液的制備方法）。取相當(dāng)于1g、1ml 、1貼或10cm2的供試液，接種至適宜體積的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或適當(dāng)稀釋的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，30~35℃培養(yǎng)48~72小時。（增菌培養(yǎng)的目的是為了避免細(xì)胞破損導(dǎo)致的細(xì)胞死亡）

選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物劃線接種至洋蔥伯克霍爾德菌群選擇性瓊脂培養(yǎng)基平板上，30~35℃培養(yǎng)48~72小時。

3.4 結(jié)果判斷

若洋蔥伯克霍爾德菌群選擇性瓊脂培養(yǎng)基上有菌落生長，若表現(xiàn)出的生長特征[菌落呈灰白、灰粉色或土黃（棕）色，周圍培養(yǎng)基由黃色變橘紅或玫紅色]等，應(yīng)進(jìn)行分離，純化，并采用適宜的鑒定試驗（必須進(jìn)行鑒定試驗，建議能鑒定出基因型的方法），確證是否為洋蔥伯克霍爾德菌群；若洋蔥伯克霍爾德菌群選擇性瓊脂培養(yǎng)基上沒有菌落生長，或有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出洋蔥伯克霍爾德菌群。

參考文獻(xiàn)

[1]Lipuma J (2005). "Update on the Burkholderia cepacia complex". Curr Opin Pulm Med. 11 (6): 528–33.

[2]中國藥典2025版通則1109 洋蔥伯克霍爾德菌群檢查法

[3]USP<60>MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS—TESTS FOR BURKHOLDERIA CEPACIA COMPLEX