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嘉峪檢測網 2025-07-08 15:54
單克隆抗體( monoclonal antibody，簡稱單抗) 藥物近年來得到快速發(fā)展，但研發(fā)周期長和成本高使其患者可及性有待提高。單抗生物類似藥與原研參照藥具有相似的安全性及有效性，生物類似藥的開發(fā)是通過逐步遞進的方式進行的，包括質量相似性、非臨床相似性及臨床相似性研究。這種遞進式研究會降低臨床研究的不確定性，提高藥物開發(fā)成功率和患者可及性。因此，單抗生物類似藥被很多生物科技公司視為重點研發(fā)方向。對原研藥的質量屬性分析和候選藥質量相似性研究是生物類似藥開發(fā)的基礎，也為臨床研究設計提供了重要依據。
本文結合國內外生物類似藥的法規(guī)要求、生物類似藥的開發(fā)和國內外申報經驗，全面闡述了單抗生物類似藥的質量相似性研究內容，特別是對于關鍵質量屬性的評價難點進行了總結，對于工藝開發(fā)具有重要的參考作用，從而幫助企業(yè)加速藥物的開發(fā)進度，也給監(jiān)管機構提供技術支撐。
單克隆抗體(簡稱單抗) 藥物始于20世紀80 年代，經歷了30 多年的發(fā)展，目前已成為生物藥的最大類別。在2019 年全球最暢銷的藥物前十榜單中，僅單抗藥物就占據6 個。為了使更多的人能夠獲得優(yōu)質的單抗藥物治療，科學家及制藥企業(yè)通過一系列的途徑降低成本。其中，生物類似藥的研發(fā)和上市將極大地降低患者使用負擔，提高單抗藥物可及性。
截至2020 年12 月，歐洲EMA 已批準69 個生物類似藥，其中單抗類藥物30 個; 美國FDA 已批準28 個生物類似藥，其中單抗類藥物19 個。中國的生物類似藥起步較晚，但發(fā)展迅猛，自2019 年2 月，復宏漢霖公司研發(fā)的中國第一個生物類似藥“漢利康®”上市后，國家藥品監(jiān)督管理局( NMPA) 已陸續(xù)批準6 個生物類似藥上市，均為單抗生物類似藥。在2020 年7 月29 日首個中國原研的單抗生物類似藥曲妥珠單抗( Zercepac®) 獲得歐洲EMA 的上市批準。
在進行單抗生物類似藥研發(fā)及申報時，往往會遇到很多難題，如比對參照藥的選擇( 參照藥批次?數量?效期等) ?分析方法的應用?相似性評價原則?產品質量屬性的評估等。本文將針對這些問題進行討論，以期為單抗生物類似藥的研發(fā)提供思路。
1、質量相似性研究
由于單抗藥物生產工藝和分子結構的復雜性，實際上不可能獲得與參照藥完全一致的產品。如何評估生物類似藥與參照藥在質量?安全?有效性上的相似性是生物類似藥研發(fā)過程中必須解決的問題。我國在生物類似藥的研發(fā)數量上位居全球第一，筆者根據單抗生物類似藥的研發(fā)實踐經驗，對質量相似性研究的解析，總結為如下4 個方面。
1. 1 基本原則
根據《生物類似藥研發(fā)與評價技術指導原則》，生物類似藥研發(fā)和評價的基本原則為: 比對原則?逐步遞進原則?一致性原則和相似性評價原則。在2021 年發(fā)布的《生物類似藥相似性評價和適應癥外推技術指導原則》中，則和歐美的指導原則一致，包括整體相似性和逐步遞進的原則。
整體相似性側重于完整的證據鏈，包含對藥學?非臨床?臨床比對研究的結果進行綜合評價。逐步遞進原則是指前期研究中，若候選藥與參照藥間存在差異，需評估該差異是否對安全性?有效性產生影響，若不確定其影響，則在后續(xù)的比對研究中應設計針對性的實驗進行評估。
1. 2 原研參照藥的考量
生物類似藥質量屬性的相似性評價接受標準，是基于原研參照藥的質量分析結果而確定的。關于原研參照藥的選擇有以下幾個方面需要考慮。
1. 2. 1 批次要求
歐洲EMA 和美國FDA 的相似性指導原則中對參照藥的要求基本一致。以美國最新的指導原則為例，應進行包含至少10 批參照藥的質量相似性比對研究，且涵蓋原研藥的效期范圍。若因特殊原因而不足10批，需及時與美國FDA 溝通進行評估。對于候選生物類似藥，需要包含6-10個代表商業(yè)化生產工藝批次樣品，通常包括關鍵臨床使用和工藝驗證批次。用于相似性研究的候選藥如果批次間發(fā)生了工藝變更，則需要提供工藝可比性研究，保證不同工藝產品在質量?安全性?有效性上的一致。
1. 2. 2 來源地考慮
在早期研發(fā)階段，通常會盡可能地收集多個來源地的原研藥為參考，進行候選藥的工藝開發(fā)及質量研究。在生物類似藥上市申請時，中國NMPA?歐洲EMA和美國FDA均要求參與質量相似性研究的參照藥應為申報地同等來源。若選擇了非申報地來源的參照藥參與相似性評估，則需要提供候選生物類似藥和不同來源參照藥兩兩間的相似性研究數據作為支持。
美國FDA 在最新的指導原則中明確提出，用在比對研究( 包括理化分析?功能研究?動物實驗和臨床研究) 中的所有參照藥和生物類似藥的數據和信息都應體現(xiàn)在生物藥上市申請( biologics license application, BLA) 資料包中。如果相似性研究中排除了某個批次的樣品，需要提供相應的評估依據。
1. 2. 3 參照藥管理
參照藥的選擇，除了批次數量和來源外，還需要關注其保存條件及管理流程。根據筆者經驗，目前國內采購參照藥周期較長，在進行頭對頭分析比對實驗時，參照藥可能會超過效期。為了解決此問題，可采用在效期前將樣品凍存，但要有相應的方案和實驗證明凍存步驟對樣品的質量屬性沒有影響，這也是國內外監(jiān)管機構所能接受的。(這里的意思是在效期之前把樣品凍存起來可以當做不過期樣品來用？)在上市申請的現(xiàn)場核查中，審評員也會關注參照藥的管理，即采購?分裝?保存和領用等記錄，以保障質量相似性研究過程中參照藥數據的真實性和可追溯性。
1. 3 分析方法
質量相似性研究是生物類似藥注冊申報的主要內容，對于應用的分析方法適用性及穩(wěn)定性要求很高: ① 需要是當前行業(yè)和技術領域最先進的，即“state-of-the-art”分析方法，要有足夠的靈敏度，能觀察到生物類似藥和原研參照藥關鍵質量屬性之間的細微差別，特別是穩(wěn)定性比對中的降解產物的識別，即“stability indicating”能力。② 對于同一質量屬性，要選擇正交的分析方法和技術進行研究，如采用基于不同的原理( 物理?化學或生物學) 的分析方法。③ 除了正常的原液( drug substance, DS) /成品( drug product, DP) 放行檢測外，質量相似性研究還應包括更全面的結構和特性鑒定研究。此類分析方法，根據其本身特性，雖不需要如放行檢測方法的驗證要求，但也要從科學角度證明其合理性?可靠性和可重復性。根據文獻報道?監(jiān)管部門審評要求和實踐經驗，一般用于質量相似性的分析方法匯總見表1。
1. 4 質量屬性的相似性可接受標準
美國FDA 在2017 年推出了一個指導原則草案( 目前已撤銷) ，該草案對質量相似性評估的屬性分級( Tier) 和相應評估策略進行了描述，包括統(tǒng)計分析方法確定相似性評估的范圍。2019年，美國FDA 發(fā)布了最新的生物類似藥質量相似性評估的指導原則，強調了質量范圍法確定相似性評估的范圍，評估方式更加靈活。歐洲EMA在2017年發(fā)布的指導原則中，介紹了統(tǒng)計學評估方法，包括Min-Max法?Tolerance Intervals 法和質量范圍法( X-sigma) ，與美國FDA 的法規(guī)中描述一致。對質量屬性的分級需要建立在對產品質量全面認知的基礎上，且需要遵循“case-by-case”的理念，表1 中的案例可供參考。需要注意的是，盡管推斷統(tǒng)計方法( inferential statistical methods) ，如等效性分析，在臨床研究中被廣泛應用，但在質量屬性評估中，受到樣本數量和樣本選擇的影響，可能會得到假陽性的結論。
在根據參照藥質量分析數據設定相似性評價標準時，要考慮到因參照藥本身工藝變化，導致一些質量屬性出現(xiàn)變化的因素。法規(guī)部門針對這個現(xiàn)象并沒有明確的建議，企業(yè)的研究人員要積累不同階段參照藥的質量數據變化趨勢，并評估這種變化對產品安全性?有效性的影響，以及相似性評價標準的合理設定。在“漢曲優(yōu)”的質量相似性研究中，觀測到有效期在2017 年3月-2021年3月的參照藥呈現(xiàn)了糖型比例( 尤其是半乳糖化和去巖藻糖化) 變化，對應的抗體依賴細胞介導的細胞毒作用( antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 和FcγRIIIa結合活性都呈現(xiàn)了一致的變化，經過評估，表明該變化和參照藥工藝變更相關，對產品的安全性及有效性無影響。
2、質量相似性研究中關鍵點的考量
質量相似性是生物類似藥研發(fā)的基礎，需要對原研藥的質量屬性進行剖析，并以此為參照開發(fā)相似藥的工藝。單抗藥物質量相似性研究重點關注的質量屬性，包括一級結構?高級結構?糖基化?蛋白質含量?電荷異質性?分子大小變異體?顆粒分析?雜質分析?生物學活性及免疫學特性等。
2. 1 一級結構
一級結構通常指其氨基酸序列，是高級結構及生物學功能的基礎。生物類似藥原則上要求氨基酸序列和參照藥保持一致。一級結構相關的質量屬性分析通常包含氨基酸序列?蛋白分子量?翻譯后修飾?二硫鍵和游離巰基等內容。
2. 1. 1 氨基酸序列及分子量
一級結構的表征方法多是基于液質聯(lián)用技術( LC-MS) ，從分子的不同水平進行分析，再輔以其他方法進行正交分析。從完整分子?亞基水平和肽段水平3個維度，可以全面地比對分析生物類似藥和參照藥的氨基酸序列的一致性。一些方法，如氨基酸定量法和Edman降解法等，可以作為正交分析方法證明氨基酸序列的一致性。除了氨基酸序列之外，生物類似藥和參照藥的鏈間和鏈內二硫鍵的連接方式是否和理論一致也十分重要，一般通過二硫鍵鑒定和游離巰基定量檢測2個方法進行評估。
2. 1. 2 二硫鍵
二硫鍵分析一般通過非還原肽圖進行鑒定。樣品經過Lyc-C和Trypsin順序酶切，得到帶有二硫鍵的肽段，進行肽段分子量和二級質譜分析，并與理論序列進行比對，以確證生物類似藥和參照藥的二硫鍵連接方式一致性。游離巰基的定量則通過Ellman試劑或其他熒光染料與巰基的反應進行，其檢測結果也能側面反映生物類似藥和參照藥的二硫鍵結構一致性。
2. 1. 3 翻譯后修飾
翻譯后修飾是單抗異質性的原因之一，也是影響其生物學活性和功能的因素之一，生物類似藥和參照藥翻譯后修飾位點和含量的一致性是質量相似性研究的重要一環(huán)。針對除糖基化之外的翻譯后修飾，按照位點和修飾類型進行分類。
2. 1. 3. 1 脫酰胺
單抗分子的天冬酰胺和谷氨酰胺會發(fā)生脫酰胺轉化為天冬氨酸和谷氨酸，是一種常見的翻譯后修飾。正常人體內的免疫球蛋白G1( immunoglobulin G1, IgG1) 和免疫球蛋白G2( immunoglobulin G2, IgG2) 在315 位和384 位天冬酰胺易發(fā)生脫酰胺修飾，有報道約23%的Asn384 發(fā)生了脫酰胺修飾，而谷氨酰胺的脫酰胺修飾常見于抗體的恒定區(qū)。脫酰胺修飾會發(fā)生在抗體的多個位點，不同位點的敏感程度不同，跟單抗高級結構有一定的聯(lián)系。若抗體分子存在NG基序，則易受到樣品處理的影響而產生高比例的翻譯后修飾。因此，在質量相似性研究中，應關注脫酰胺修飾的位點和比例，評估其對單抗分子的安全性和有效性的影響。
2. 1. 3. 2 氧化
抗原互補決定區(qū)( complementarity determining region,CDR) 中甲硫氨酸( methionine,M) 氧化可能會影響抗原結合活性; 抗體可結晶區(qū)域( crystallizable fragment,Fc) 的氧化修飾可能會影響抗體的熱穩(wěn)定性?蛋白A( protein A) 結合能力和新生兒受體( neonatal Fc receptor,FcRn) 結合活性。因此，在評估氧化修飾時，應同時關注其氧化修飾的位點和水平。
例如，F(xiàn)c 段的M252和M428是較易發(fā)生氧化修飾的2 個位點，構象上比較接近，均位于CH2 /CH3 的交界表面，臨近FcRn 結合區(qū)域和Protein A 結合區(qū)域。研究表明，約40% 的M252氧化修飾會顯著降低單抗血清半衰期。然而，單抗分子普遍存在低比例的M252和M428氧化修飾，如赫賽汀和其生物類似藥分別發(fā)現(xiàn)有約4%和10%的氧化修飾。
2. 1. 3. 3 N-端修飾
單抗分子的N-端多發(fā)生谷氨酰胺或谷氨酸的環(huán)化反應而形成焦谷氨酸，是生物體內比較常見的修飾，一般認為其不影響生物學活性和功能，但該修飾和單抗的電荷異質性相關，相似性研究中可結合電荷異質性分析結果綜合評估。
2. 1. 3. 4 C-端修飾
血清中的抗體重鏈C-端通常為甘氨酸，而IgG 的編碼基因顯示C-端為賴氨酸。研究表明，在體內存在一種內源羧肽酶B，可以將抗體的C-端賴氨酸切除。因此，在質量相似性研究中，通常認為C-末端賴氨酸的切除不影響產品的安全性和有效性。在單抗生產過程中，C-端賴氨酸未完全切除會導致單抗的電荷異質性發(fā)生變化。因此，在電荷異質性的相似性評估中要考慮這種修飾帶來的影響。
一些其他修飾如異構化?胱氨酸化?糖化等，應結合其含量?位點和相關活性及功能研究進行相似性評估。
2. 2 高級結構
高級結構對單抗藥物的生物學功能發(fā)揮十分重要，采用正交技術從各個方面對其進行相似性評估，包括抗體二級結構及三級結構分析。
二級結構分析一般采用遠紫外圓二色譜和紅外光譜2種技術，三級結構通過近紫外圓二色譜的方法進行分析; 差示掃描量熱分析通過蛋白質的熱穩(wěn)定性變化反映結構的變化; 熒光光譜則反映蛋白質中特定氨基酸( 色氨酸等) 在空間的位置和環(huán)境; 蛋白質的核磁圖譜取決于其所有的高級結構形式，包括氨基酸類型?二級結構和三級結構引起的化學位移，以及氫氘交換的動力學差異; 超速離心方法通過對比蛋白質單體?碎片及聚體在自然狀態(tài)下的沉降速率，從而反映蛋白質在溶液狀態(tài)下的高級結構差異。
由于高級結構的分析方法多為定性方法，其比對方式多為圖譜相似; 或者采用一些經驗模型對圖譜進行進一步解析，獲得一些參數進行相似度比較。經驗模型多來源于文獻或者自建，因此需要在分析結果處備注計算的軟件或模型出處。例如，采用Thermo OMINC 計算圖譜相似度，數值越接近于1，說明圖譜越相似。但此方法需要一定的實驗次數，且對微小信號的差異不敏感，仍需結合圖譜目視比較進行分析。Amgen 公司的科學家提出一種WSD( weighed spectra difference) 的計算公式，通過加權偏差計算的方式，更敏感地反映圖譜間差異。對于高級結構分析而言，統(tǒng)計學分析手段的應用將是趨勢。
2. 3 糖基化
治療用單克隆抗體制品是一種糖蛋白，單抗的糖基化通常發(fā)生在Fc段，較少情況下發(fā)生在Fab端。在相似性研究中，主要從有效性和安全性兩個方面對糖基化進行評價。糖基化對有效性的影響表現(xiàn)在不同糖型對抗體空間結構的影響，從而影響到Fc 段介導的效應功能。不同單抗藥物的作用機制不同，糖型類別的相似性評價要求也相應不同。如IgG2/IgG4亞型的單抗藥物，因為CH2 結構域里對Fcγ 受體和補體C1q( complement C1q) 結合能力特異的氨基酸序列缺失，導致其ADCC 和補體依賴細胞毒作用( complementdependent cytotoxicity,CDC) 較弱，此類抗體一般用來中和抗原或阻斷受體配體的結合; 因此，這類抗體的去巖藻糖化糖( Afuc) 和半乳糖苷化糖( Gal)風險級別不高，相似性評價中主要考慮其能反映抗體的結構完整性和工藝一致性屬性。對于IgG1亞型抗體，ADCC 和CDC 效應是其典型的作用機制，如利妥昔單抗，Gal，Afuc 和高甘露糖( Man) 的相似性評價要重點考慮; 但也要遵守case-by-case 的原則，如曲妥珠單抗[4]和貝伐珠單抗，前者因為人表皮生長因子受體2 ( human epidermal growth factorreceptor 2,HER2) 高表達抑制補體通路，缺失CDC效應，后者因為靶向可溶性抗原，MoA 中ADCC 和CDC 效應均缺失，相應糖型的微小差異并不影響產品有效性。還有研究表明，含有高比例Man5 修飾的抗體在血清中的半衰期會降低。
糖基化對安全性的影響主要是免疫原性，表現(xiàn)為末端唾液酸和α-1,3連接半乳糖。唾液酸有N-羥乙酰神經氨酸( N-glycolylneuraminic acid,NGNA) 和N-乙酰神經氨酸( N-acetylneuraminic acid,NANA) 2 種形式，NANA 類型的唾液酸在正常人血清抗體中普遍存在，而人體內存在抗NGNA 抗體，Reusch等研究報道了抗NGNA 抗體引發(fā)的免疫反應。在部分由鼠源細胞表達生產的抗體中，存在NGNA和α-1,3連接半乳糖的修飾，但對于大多數由中國倉鼠卵巢細胞表達的單抗產品，NGNA 和α-1,3 連接半乳糖的含量通常低于檢測方法的檢測限，在這種情況下相似性研究的評級可考慮為中等級別。
2. 4 含量
含量是相似性評價的重要內容，生物類似藥的制劑處方和規(guī)格原則上要和參照藥一致，因此需要評價蛋白濃度的相似性，歐洲EMA 的生物類似藥指導原則明確指出了“strength”要相似。對于液體或凍干制劑，蛋白濃度的測定通常采用紫外分光光度法，在頭對頭的比對分析中，消光系數也是非常重要的一環(huán)。
蛋白質的消光系數通常由氨基酸序列決定。在研發(fā)早期通常采用理論消光系數的數值進行濃度測定，在工藝開發(fā)進入一定的階段后( 工藝參數鎖定)，通常需要對消光系數進行實驗確認。推薦采用氨基酸含量測定?凱氏定氮法?Edelhoch 法等多種方法，對蛋白質的消光系數進行測定和評估，并建立可接受標準，最終確定消光系數。對于生物類似藥而言，不能僅僅根據市售產品的標識濃度反推獲得，而是要采用實驗方法確定。
2. 5 電荷異質性
抗體在生產?儲存和運輸過程中，會產生蛋白分子的翻譯后修飾以及聚體和碎片，導致了具有不同等電點( isoelectric point,pI) 蛋白變異體的產生。相似性評價對電荷異質性要求較高，首先要通過色譜技術( 適用于IgG1抗體) ，或者自由流電泳技術( 適用于IgG2和IgG4抗體) 制備和富集抗體中的酸和堿性變異體，鑒定其形成原因，建立結構和功能的關系( structure-function relationship,SFR)，并評估各變異體對安全性和有效性的影響; 其次，需要建立合適的分析方法，對各酸堿組分的含量進行分析?統(tǒng)計計算和相似性評價?？贵w的電荷變異體分析，根據不同的原理可采用離子交換色譜法( ion exchange chromatography, IEX) 和毛細管等電聚焦技術( capillary isoelectric focusing,cIEF)，前者是根據不同電荷變異體表面電荷的差異在色譜柱上實現(xiàn)分離，后者是根據不同變異體的等電點差異進行分離分析。電荷異質性受蛋白表達平臺( 細胞株和培養(yǎng)工藝) 和純化工藝影響很大，工藝開發(fā)中要平衡生產收率和相似性評價2 個因素，例如對于C 末端賴氨酸剪切程度不同引起的堿性組分，如前文描述，其不會影響臨床安全性和有效性，相似性評價時樣品可經過CpB 酶切后進行測試和評估。
2. 6 分子大小變異體
分子大小變異體為產品相關雜質，主要表現(xiàn)為高分子量物質( high molecular weight species,HMWS) 和低分子量物質( low molecular weight species,LMWS) ，具有潛在的安全性影響，是需要嚴格控制的質量屬性。HMWS 的鑒定采用多角度激光光散射檢測器(multi-angle light scattering,MALS) 和超速離心分析(analytical ultracentrifugation，AUC) ，定量分析通常采用2 種正交的分析技術，即體積排阻色譜(size exclusion chromatography,SEC) 和AUC; LMWS 的評估采用毛細管電泳分析技術(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS) 。在相似性評估中，首先要確認候選藥的HMWS和LMWS 的種類和含量要與參照藥相似，否則要加以鑒定和評估; 其次，純度和雜質的定量分析方法要經過驗證，特別是雜質含量的定量限(limit of quantitation,LOQ) 或檢測限(limit of detection,LOD) 驗證; 最后，相似性評估的標準是建立在至少10 批次以上參照藥分析數據的基礎上計算得出。對于雜質的范圍，可采用單邊的限定方式，但不應該超出放行標準范圍。
2. 7 顆粒分析
蛋白顆粒是抗體藥物的重要質量屬性之一，與產品的安全性息息相關。顆粒粒徑在100 nm -1μm 被定義為亞微顆粒，1-100μm 通常為亞可見顆粒，大于100 μm為可見顆粒，小于100 nm為可溶性聚體或者蛋白分子。通常，可見顆粒和聚體在生產過程中被嚴格監(jiān)控，并控制在極低水平下; 對于亞可見微粒，有體外實驗表明其可能引起免疫原性，且有堵塞毛細血管的風險。
在質量相似性評估中，顆粒分析通常不進行考察，需要在候選藥的放行和穩(wěn)定性中進行監(jiān)控和評估。但一些國內外的生物類似藥的相似性研究中都包含了此項比對，如Amgen公司利用微流成像法(micro-flow imaging,MFI) 和光阻法(light obscuration,LO) 比對了貝伐珠單抗和阿達木單抗類似藥的亞可見顆粒，采用動態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS) 和場流分析(field flow fractionation,FFF) 研究比對了亞微顆粒; 上海復宏漢霖公司采用DLS 和MFI 分析了曲妥珠單抗及其生物類似物的顆粒表現(xiàn)。
2. 8 雜質分析
根據ICH Q6B，單抗產品的雜質可以分為產品相關雜質(product-related impurities) 和工藝相關雜質(process-related impurities) 2 類。在相似性評估中，對產品相關雜質的評估主要在于其對安全性?有效性的影響。工藝相關雜質和產品相關雜質一樣，能引起安全性風險，是需要嚴格控制的，包括如: 細胞株構建和細胞培養(yǎng)過程引入的殘留宿主細胞蛋白?宿主細胞DNA?抗生素?糖型調節(jié)劑?保護劑等，下游工藝引入的殘留Protein A 以及殘留于制劑終產品中的內毒素和浸出物等，工藝相關雜質種類和殘留量取決于具體工藝情況。這些雜質是不需要和參照藥相似，但要采用先進靈敏的分析方法進行檢測和必要控制，使其在安全的限值以內。因此，工藝相關雜質不在相似性研究范圍內。
2. 9 生物學活性
生物學活性和藥物的MoA 相關。生物學活性分析是相似性評價的重點，根據抗體結構分為Fab，F(xiàn)c以及Fab /Fc 共同參與的功能?？乖贵w結合活性是單抗活性的基礎，屬于Fab 端的功能區(qū)。Fc 段的生物學功能將在免疫學特性章節(jié)介紹。Fab /Fc 共同調節(jié)的生物學功能包括ADCC，CDC 及抗體介導的細胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP) 等。
生物學活性的評估應根據藥物MoA，并遵循case-by-case 的相似性評價原則。如IgG1抗體具有較強的Fcγ 受體和C1q 結合能力，因此具有較強的ADCC和CDC作用; 如利妥昔單抗的相似性評價的級別通常為高或中等; 而曲妥珠單抗ADCC 在相似性評價中被評為了高等級，但HER2高表達的細胞會抑制補體途徑，CDC為陰性，所以相似性評價中被設為低等級; 阿達木單抗的MoA為與可溶性腫瘤壞死因子α( tumor necrosis factor α，TNFα) 特異性結合以阻斷其與細胞表面TNFα 受體相互作用，因此相似性評價中抗體中和活性為高等級，ADCC和CDC活性為低等級。此外，對于利用抗體Fab 端特異結合，阻斷內皮/表皮生長因子通路信號的機制，細胞增殖抑制活性應為高等級，如貝伐珠單抗和曲妥珠單抗; 對于Fc 段介導的效應細胞殺傷作用低的IgG2和IgG4，阻斷效應功能應為高等級，如抗PD-1抗體。同時，在《生物類似藥相似性評價和適應證外推技術指導原則》中提出，生物類似藥的適應證外推應針對適應證類型設計合適的生物學活性比對方案。
生物學活性與分子的翻譯后修飾?糖基化水平?高級結構等質量屬性密切相關，對以上屬性相似性有不確定性時，可以用生物學活性進一步說明和佐證。
2. 10 免疫學特性
抗體是獲得性免疫系統(tǒng)的關鍵組成部分，其相對保守的Fc段具有特定的免疫學特性。治療性抗體藥物的Fc段生物學功能包含對Fc受體結合能力及C1q結合能力的評價。
FcRn在體內參與血清IgG的回收，影響血清半衰期，進而影響藥效，相似性研究中，抗體的FcRn結合能力通常歸為中等級。
C1q是補體經典激活途徑的第一個結合蛋白，與IgG的Fc段結合后能夠啟動CDC效應; FcγRIIIa結合能力與高甘露糖化和去巖藻糖化修飾密切相關，從而影響抗體的ADCC 效應，C1q和FcγRIIIa 結合能力在相似性評估中通常被定義為中等級。特定情況下，比如ADCC和CDC不是MoA，但C1q和FcγRIIIa 結合能力可以評估Fc段的糖鏈結構以及抗體高級結構完整性，所以也將其歸為中等級；FcγRIa，F(xiàn)cγRIIa(R)，F(xiàn)cγRIIa(H)，F(xiàn)cγRIIb/c和FcγRIIIb與糖型修飾關聯(lián)不如FcγRIIIa 緊密，通常歸為低等級。
值得注意的是，通常認為抗體與FcγRIIIa 的結合能力和糖型中Man% 和Afuc% 的含量有關聯(lián)，但需要根據糖型的比例進行綜合考量。如Amgen 公司的貝伐珠單抗生物類似藥中，雖然觀察到類似藥和原研藥中Man%和Afuc%的含量微小差異，但在FcγRIIIa結合能力的結果中顯示了高度相似性。因此，Man%和Afuc%微小差異不影響產品有效性。
2. 11 穩(wěn)定性研究
國內外的生物類似藥指導原則中，均提到了對生物類似藥和參照藥進行頭對頭的穩(wěn)定性研究，包括加速穩(wěn)定性和強制降解試驗，以觀察生物類似藥和參照藥的降解趨勢和途徑的相似性評價。
根據《生物制品穩(wěn)定性研究技術指導原則(試行)》，對于4℃保存條件下的產品，加速穩(wěn)定性研究通常在25℃的條件下開展，選擇的生物類似藥和參照藥的批次數及研究周期?檢項應根據實驗設計和目的進行選擇。最終可以觀察到生物類似藥和參照藥在加速條件下的穩(wěn)定性趨勢的相似性。強制降解研究中包含了高溫?光照?強酸?強堿?振搖?氧化和凍融等條件，在經歷了這些條件后，通過監(jiān)測抗體一級結構?純度和雜質?電荷異質性?生物學活性等變化趨勢，最終進行相似性比對。值得注意的是，對于產品有效期，在歐洲EMA的指導原則中推薦采用生物類似藥自身穩(wěn)定性研究結果而定，不用和參照藥進行效期比對。
3、結論和展望
質量相似性是生物類似藥研究和開發(fā)的前提，決定了工藝開發(fā)的方向，為非臨床和臨床研究方案的設計提供參考。本文是基于多年來對生物類似藥的開發(fā)和國際申報經驗，在總結國內外最新生物類似藥法規(guī)基礎上，對抗體類生物類似藥的質量相似性研究進行了總結。系統(tǒng)介紹了質量相似性研究的逐步遞進原則和整體相似性原則，從參照藥、分析方法、相似性評價標準以及研究關鍵點方面，全面介紹了生物類似藥的質量相似性研究和評價，為抗體研發(fā)企業(yè)提供參考。國內外生物類似藥的市場巨大，制藥企業(yè)的技術和平臺逐漸成熟，監(jiān)管體系也越來越完善，如何實現(xiàn)規(guī)范化、系統(tǒng)化引導，如原研藥質量信息共享、相似性評價標準的統(tǒng)一化、靶點和產能的優(yōu)化，形成數據共享和產能的宏觀引導，避免資源浪費，是將來制藥企業(yè)和監(jiān)管機構面臨的新挑戰(zhàn)和機會。
一點感想
從文中作者引用了大量Amgen的文獻可以看出，復宏漢霖的研究人員對于Amgen的仿制藥與原研藥的相似性評價進行了深入的分析，并應用于自己公司的仿制藥相似性評價。我自己在文獻調研的過程中也會發(fā)現(xiàn)大量的國外MNC公司發(fā)表的文章，比如各種稀奇古怪的案例等等。反觀國內的藥企，缺乏的是對某些小而重要的問題進行深入研究的精神，也不是很注重藥物的質量研究。當然，隨著越來越多的藥企出海撈錢，與國外的質量研究標準接軌是必然的，相信這會促進國內藥物質量研究的發(fā)展。
參考文獻：
1.李思鵬,張仲理,許圣昌,張磊.單抗生物類似藥與原研藥質量相似性研究解析[J].中國新藥雜志,2022,31(6):523-531.
來源：Internet
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