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常常聽到萌新師妹抱怨，細(xì)胞凍存得好好的，后面想用時怎么就用不了呢？

實(shí)際上，細(xì)胞凍存的重要性不亞于細(xì)胞培養(yǎng)。小析姐在此對細(xì)胞凍存的原理及方法步驟進(jìn)行梳理，希望能夠幫助到為細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)「頭禿」的科研人。

一、細(xì)胞凍存的原理

傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存（甘油/二甲基亞砜作為保護(hù)劑）實(shí)驗(yàn)講求的要點(diǎn)是：慢凍速溶。

細(xì)胞凍存時向培養(yǎng)基中加入的甘油或二甲基亞砜（DMSO），這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。

當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)中晚期，以培養(yǎng)基制備高濃度細(xì)胞懸液，加入細(xì)胞保護(hù)劑，等份轉(zhuǎn)移至凍存管中，緩慢冷凍，后轉(zhuǎn)移至液氮環(huán)境中長期保存。

二、細(xì)胞凍存的步驟

1.  預(yù)先配制凍存液：按正常培養(yǎng)基：DMSO =9:1比列配制凍存液；

2.  取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰蛋白酶將單層生長的細(xì)胞消化下來，離心轉(zhuǎn)速為1000 rpm，離心時間為5 min；

3.  去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量提前配制好的細(xì)胞凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/mL～1×107/mL；

4.  將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管體積約為1～1.5 ml；

5.  在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間、細(xì)胞代數(shù)及操作者的名字，以便于后續(xù)溯源信息；

6.  提前往凍存盒中加入異丙醇（在負(fù)八十冰箱中能以1℃/min的速度下降），隨后放入-80℃的低溫冰箱即可，建議凍存時間為12小時以上。凍存完成的細(xì)胞一般能夠在-80℃冰箱中保存半年至一年，長期保存要轉(zhuǎn)移至液氮中，商用凍存液可以直接將凍存管放置于-80℃冰箱中。

纏有封口膜的凍存管，從液氮拿出來時場景，是這樣的 

纏有封口膜的凍存管，細(xì)胞復(fù)蘇時場景，又是這樣的

細(xì)胞凍存時，凍存管管口到底要不要纏封口膜？

1、細(xì)胞凍存管管口不纏封口膜的原因：

a、封口膜在負(fù)80 冰箱長時間凍存會變性松開或斷裂，尤其在液氮罐內(nèi)長期保存更容易變性、脫落，污染液氮。

b、細(xì)胞復(fù)蘇時，松動或脫落的封口膜會影響實(shí)驗(yàn)操作。脫落到水浴鍋內(nèi)，增加污染（塑料垃圾污染和微生物污染）概率。

c、實(shí)驗(yàn)室剪裁封口膜時，就沒有準(zhǔn)備適合凍存管口寬度的封口，拿啥纏呢。

d、省錢省時間。十年來，凍存了2萬多管細(xì)胞。要是每管都貼封口膜，剪裁后的封口膜連接在一起，是否可以繞地球走1/10000圈呢。

e、纏上風(fēng)封口膜，凍存盒相鄰的凍存管會很擠，很難放入凍存盒。

2、多年實(shí)驗(yàn)實(shí)踐和經(jīng)驗(yàn)表明：不貼封口膜，凍存液不會溢出來（密封性），也不會增加污染概率，更不會影響凍存管的安全性。

所以，我們實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞時，凍存管口不纏封口膜。

3、細(xì)胞凍存時，將凍存管放入程序降溫盒前，輕輕擰緊一下管蓋。避免凍存后管蓋縫隙微小收縮，入液氮后，液氮進(jìn)入凍存管內(nèi)?？山档图?xì)胞復(fù)蘇時，脹氣后出現(xiàn)爆的概率。