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摘要

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是全球性的公共衛(wèi)生問題, 隨人口老齡化而加劇。核酸藥物在該領(lǐng)域潛力巨大, 通過堿基互補(bǔ)配對原理靶向特定基因序列, 于蛋白質(zhì)表達(dá)前進(jìn)行干預(yù), 具有靶向性高、安全性好且研發(fā)周期短的優(yōu)勢。然而, 血腦屏障的存在和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理復(fù)雜性限制了核酸藥物的遞送, 其療效依賴于有效的遞送系統(tǒng)。本文系統(tǒng)介紹了近年來用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的核酸藥物及其作用機(jī)制, 深入分析腦部遞送障礙, 重點(diǎn)闡述了血腦屏障的生理結(jié)構(gòu)、功能及可實(shí)現(xiàn)遞送的途徑及其相關(guān)機(jī)制。詳述了利用病毒載體、核酸藥物改造技術(shù)、脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒和外泌體等突破血腦屏障的機(jī)制及其在核酸藥物遞送中的應(yīng)用。本綜述旨在匯總和分析當(dāng)前核酸藥物跨越血腦屏障、提高靶向性和穩(wěn)定性的策略, 探討提高遞送效率的方法, 并為未來的研究和臨床應(yīng)用提供指導(dǎo), 以期推動(dòng)核酸藥物在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的發(fā)展。

 

關(guān)鍵詞

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病; 血腦屏障; 核酸藥物; 基因治療; 藥物遞送系統(tǒng)

 

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)包括大腦和脊髓, 是人體神經(jīng)系統(tǒng)的核心部分。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是全球健康的重大挑戰(zhàn), 包括阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、帕金森病(Parkinson's disease, PD)及亨廷頓病(Huntington's disease, HD)等神經(jīng)退行性疾病, 自閉癥譜系障礙、Rett綜合征等神經(jīng)發(fā)育障礙, 以及腦卒中、腦腫瘤和多發(fā)性硬化癥等。這些疾病影響著全球數(shù)億人口, 已成為全球第二大死亡原因, 其死亡率和致殘率負(fù)擔(dān)隨人口老齡化加劇而持續(xù)上升。

傳統(tǒng)藥物治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病面臨諸多挑戰(zhàn), 其中血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)是關(guān)鍵限制因素。BBB由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)血管單元中的周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用形成, 是一種選擇性通透屏障。它在保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受毒素、病原體、炎癥、損傷和疾病侵害等方面發(fā)揮著重要作用, 但同時(shí)也限制了大多數(shù)候選藥物通過外周給藥進(jìn)入。因此, 目前神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療藥物有限, 可用的治療方案少, 新藥的批準(zhǔn)率低。

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中, 部分傳統(tǒng)小分子藥物因其較小的分子質(zhì)量和較高的脂溶性, 能夠有效穿透BBB, 通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)控離子通道及提供神經(jīng)保護(hù)等機(jī)制發(fā)揮作用。例如, 左旋多巴用于改善帕金森病癥狀、苯妥英鈉用于癲癇發(fā)作, 以及多奈哌齊用于阿爾茨海默病緩減癥狀等。但這類藥物通常存在特異性弱、難以精準(zhǔn)調(diào)控基因?qū)用娴牟±頇C(jī)制等局限性。蛋白藥物(如單克隆抗體和神經(jīng)生長因子等)具有較好的特異性, 通常通過特異性結(jié)合病理分子、調(diào)節(jié)信號通路并清除有害蛋白等方式實(shí)現(xiàn)治療效果, 如單克隆抗體可通過清除特定的致病蛋白(如阿爾茨海默病中的β-淀粉樣蛋白)來減緩疾病進(jìn)展。但蛋白類藥物在臨床應(yīng)用中也面臨著BBB穿透困難、生產(chǎn)成本高及潛在的免疫反應(yīng)等挑戰(zhàn)。

相比之下, 核酸藥物在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。傳統(tǒng)藥物主要針對蛋白靶點(diǎn), 僅覆蓋已知致病靶點(diǎn)的15%, 而核酸藥物通過干預(yù)基因轉(zhuǎn)錄和信使RNA(messenger RNA, mRNA)環(huán)節(jié), 理論上可靶向任何可轉(zhuǎn)錄基因序列, 極大擴(kuò)展了潛在的治療靶標(biāo)?；趬A基配對的序列特異性設(shè)計(jì), 核酸藥物能夠精準(zhǔn)識別目標(biāo)基因, 顯著降低脫靶效應(yīng), 提高治療安全性。此外, 核酸藥物具有較高的生產(chǎn)效率, 一旦解決其遞送和化學(xué)性質(zhì)等關(guān)鍵問題, 僅需改變靶基因序列即可快速開發(fā)新藥, 大幅縮短研發(fā)周期。然而, 核酸藥物需在胞內(nèi)發(fā)揮作用, 其固有的高負(fù)電荷密度及體內(nèi)核酸酶引起的不穩(wěn)定性要求核酸藥物的體內(nèi)遞送需依賴載體介導(dǎo)。因此, 載體的開發(fā)需要基于對體內(nèi)生理屏障的深入研究, 包括循環(huán)中的降解清除與蛋白吸附、血腦屏障、細(xì)胞攝取障礙、內(nèi)吞體/溶酶體屏障, 以及藥物控制釋放機(jī)制等。目前, 聚合物納米顆粒、脂質(zhì)納米顆粒、無機(jī)納米顆粒和外泌體等工程載體已被廣泛開發(fā)用于將核酸藥物輸送到大腦。通過調(diào)整載體的物理和化學(xué)特性, 引入官能團(tuán)進(jìn)行表面修飾, 可增強(qiáng)載體的穩(wěn)定性、提高其對免疫監(jiān)控的逃逸能力、優(yōu)化器官靶向性和細(xì)胞定向性, 以及提升對微環(huán)境的敏感性等。

本文介紹了目前有潛力用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的核酸藥物及其作用機(jī)制; 概述了BBB作為核酸藥物遞送的主要障礙, 穿越BBB的主要方法及相關(guān)機(jī)制機(jī)理; 重點(diǎn)討論了各種遞送系統(tǒng)(如病毒載體、核酸藥物偶聯(lián)、脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒和外泌體等)的特性及它們在介導(dǎo)核酸藥物腦部遞送方面的相關(guān)進(jìn)展。

 

1核酸藥物的分類及其作用機(jī)制

核酸藥物的作用機(jī)制根據(jù)其生物學(xué)效應(yīng)可分為3個(gè)主要類別: 下調(diào)基因表達(dá)、上調(diào)基因表達(dá)和基因編輯。小干擾核糖核酸(small interfering RNA, siRNA)、小分子核糖核酸/微核糖核酸(microRNA, miRNA)和反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASOs)是通過與靶RNA配對來抑制靶基因的典型核酸藥物。mRNA和質(zhì)粒脫氧核糖核酸(plasmid DNA, pDNA)通常用于增加靶基因的表達(dá)。而成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein, CRISPR/Cas)系統(tǒng)可以增加、抑制或糾正靶基因的表達(dá)。

1.1 siRNA

siRNA也叫作沉默RNA, 通常以雙鏈形式存在, 單鏈形式發(fā)揮作用, 由21到25個(gè)核苷酸組成, 3′端一般有兩個(gè)游離的堿基。它可以由長的雙鏈RNA或小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA, shRNA)經(jīng)Dicer酶(一種特殊核糖核酸酶, 屬于RNase III家族)特異性識別并切割形成(內(nèi)源性), 也可以由化學(xué)合成的方法轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中(外源性)。siRNA可以通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)機(jī)制, 特異性地促進(jìn)靶細(xì)胞質(zhì)中靶mRNA降解或抑制其翻譯表達(dá), 產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)。

在細(xì)胞質(zhì)中, siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC)結(jié)合后, 解旋成單鏈。正義鏈被降解, 而與目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本(完全)互補(bǔ)的反義鏈作為導(dǎo)向子(guide strand)留在RISC上, 形成活性的RISC-siRNA復(fù)合物。一旦RISC-siRNA復(fù)合物與目標(biāo)mRNA相互匹配, RISC上具有核酸內(nèi)切酶活性的Argonaute蛋白將引導(dǎo)該mRNA的降解或阻止其翻譯成蛋白質(zhì)(圖1A)。通過這一機(jī)制, siRNA能夠精準(zhǔn)沉默目標(biāo)基因的表達(dá), 在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用。這種基因沉默效果是可逆的, 只要停止給予siRNA藥物, 靶基因就會恢復(fù)表達(dá)。siRNA可以針對任何編碼蛋白質(zhì)或非編碼RNA的基因, 具有高效率和高度特異性, 目前已有多種siRNA藥物獲批上市。其中, ONPATTRO是FDA批準(zhǔn)的首款siRNA藥物, 用于治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性伴多發(fā)性神經(jīng)病, 是RNAi領(lǐng)域的一個(gè)里程碑事件。

1.2 miRNA

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子, 長度約為19~24個(gè)核苷酸。miRNA在細(xì)胞內(nèi)通過參與RNAi機(jī)制來調(diào)控基因表達(dá), 從而影響細(xì)胞的生理過程。miRNA的作用機(jī)制與siRNA類似, 但也有一些獨(dú)有的特征。miRNA可通過與靶mRNA的3′非編碼區(qū)(untranslatd region, UTR)或編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合, 導(dǎo)致靶mRNA的降解或翻譯抑制, 從而影響細(xì)胞的生長、分化、凋亡、代謝等多種生理過程。內(nèi)源性的pre-miRNA在進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中后由Dicer切割成約22個(gè)核苷酸的不完全配對的雙鏈RNA, 一條鏈(passenger strand)降解, 另一條鏈作為guide strand與Argonaute蛋白結(jié)合形成RISC。RISC通過miRNA的5′端與靶基因mRNA的3′UTR部分互補(bǔ)結(jié)合, 抑制目標(biāo)mRNA的翻譯或促進(jìn)其降解(圖1A)。這一過程導(dǎo)致目標(biāo)基因的表達(dá)下調(diào), 實(shí)現(xiàn)了miRNA在基因調(diào)控中的功能。siRNA與miRNA都是通過RNAi的方式來發(fā)揮作用, 但是也存在一些不同。miRNA來源于較短的莖環(huán)RNA產(chǎn)物, 主要作用于靶標(biāo)基因的3′UTR區(qū), 可以通過不完全配對抑制翻譯或者降解mRNA來沉默基因, 在翻譯水平和轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用, 具有更廣泛的調(diào)控范圍。而siRNA具有100%的互補(bǔ)性, 通常進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控, 即通過在翻譯前切割mRNA導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解, 具有更高的特異性。

1.3 ASOs

ASOs是人工合成的單鏈核酸聚合物, 通常由18~30個(gè)核苷酸組成。它們與目標(biāo)基因的特定RNA序列互補(bǔ)結(jié)合, 通過干擾mRNA功能實(shí)現(xiàn)治療效果(圖1B)。ASOs主要通過3種機(jī)制調(diào)控基因表達(dá): 降解mRNA(招募RNase H切割降解mRNA, 阻斷蛋白質(zhì)合成); 抑制翻譯(ASOs與mRNA結(jié)合, 阻止mRNA與核糖體結(jié)合, 降低蛋白質(zhì)合成); 調(diào)控剪接(ASOs結(jié)合于pre-mRNA的外顯子區(qū)域, 使外顯子被剪切掉, 糾正基因剪接異常)。ASOs因其高度特異性在治療基因相關(guān)疾病, 如脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy, SMA)和遺傳性視網(wǎng)膜病變等方表現(xiàn)出色。

Figure 1 Classification and mechanisms of action of nucleic acid drugs, including siRNA and miRNA (A), ASOs (B), mRNA and pDNA (C), CRISPR/Cas (D), aptamer (E). ASOs: Antisense oligonucleotides. Created in https://www.BioRender.com

1.4 mRNA

mRNA是一種單鏈長核糖核酸, 傳遞DNA中的遺傳信息并翻譯合成蛋白質(zhì)(圖1C)。其結(jié)構(gòu)包括5′端帽子結(jié)構(gòu), 保護(hù)mRNA免受降解并促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯; 5′端UTR, 調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率; 編碼序列, 翻譯成蛋白質(zhì); 3′端UTR, 影響mRNA穩(wěn)定性和降解; 以及多聚腺苷酸尾巴, 保護(hù)mRNA并增加其轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯效率。

mRNA在核酸藥物療法、診斷生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)等方面應(yīng)用廣泛。細(xì)胞內(nèi)的mRNA可以翻譯產(chǎn)生治療性蛋白, 替代有缺陷或缺失的蛋白。進(jìn)入體內(nèi)的mRNA由細(xì)胞表達(dá)特定蛋白, 避免體外因素影響, 并調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng), 消除包括癌細(xì)胞在內(nèi)的威脅。編碼抗原序列的mRNA疫苗通過脂質(zhì)納米載體遞送進(jìn)入細(xì)胞, 由人體細(xì)胞翻譯產(chǎn)生抗原, 激活免疫反應(yīng)。mRNA療法主要應(yīng)用于傳染病疫苗、治療性癌癥疫苗、免疫腫瘤學(xué)疫苗和蛋白質(zhì)替代等。

1.5 pDNA

pDNA是一種環(huán)狀雙鏈DNA分子, 可以獨(dú)立于染色體或核區(qū)復(fù)制, 主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。它通常包含一個(gè)或多個(gè)外源基因及其調(diào)控元件, 如啟動(dòng)子、終止子和選擇性標(biāo)記基因。通過轉(zhuǎn)染等方法, pDNA可將外源基因?qū)肽繕?biāo)細(xì)胞, 隨后被轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成蛋白質(zhì), 用于糾正或補(bǔ)充缺失或異?；?圖1C)。作為基因載體, pDNA具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的能力, 在子代細(xì)胞中保持恒定拷貝數(shù), 表達(dá)所攜帶的遺傳信息。pDNA因其安全、低毒、低免疫原性和易于分離提取等優(yōu)點(diǎn), 廣泛應(yīng)用于基因治療、細(xì)胞治療和核酸疫苗等領(lǐng)域。

基于pDNA的基因治療是將治療基因整合到質(zhì)粒載體中, 通過各種遞送方式(如電穿孔、脂質(zhì)體、病毒載體等)將質(zhì)粒導(dǎo)入靶細(xì)胞, 從而實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)以治療疾病的一種基因治療策略。DNA疫苗是將編碼特定抗原的基因序列插入質(zhì)粒載體中, 通過注射使機(jī)體細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)抗原, 從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的一種新型疫苗技術(shù)。相較于mRNA, pDNA更具成本效益、可運(yùn)輸性和穩(wěn)定性。然而, 其缺點(diǎn)也十分明顯, 主要是轉(zhuǎn)染效率低且表達(dá)起效慢, 因?yàn)閜DNA需要跨越核膜進(jìn)入細(xì)胞核才能發(fā)揮作用, 且需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)步驟才能產(chǎn)生蛋白質(zhì)。此外, pDNA還存在潛在的基因組整合風(fēng)險(xiǎn)和免疫原性問題, 其較大的分子質(zhì)量也增加了細(xì)胞遞送的難度。

1.6 CRISPR/Cas

CRISPR/Cas是一種存在于原核生物(細(xì)菌和古細(xì)菌)的免疫系統(tǒng), 能夠在遭到病毒后提取出病毒的一小段DNA存儲到自身基因組的特定區(qū)域上(CRISPR存儲空間)。當(dāng)再次遇到病毒入侵時(shí), 原核生物根據(jù)存儲的DNA識別并切割病毒DNA。CRISPR/Cas系統(tǒng)包含CRISPR基因座和Cas基因兩部分。CRISPR基因序列包括前導(dǎo)序列(leader)、重復(fù)序列(repeat)和間隔序列(spacer)(圖1D)。前導(dǎo)序列位于CRISPR基因上游, 引導(dǎo)重復(fù)和間隔序列的轉(zhuǎn)錄; 重復(fù)序列含20~50個(gè)堿基對, 形成穩(wěn)定RNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu); 間隔序列存儲細(xì)菌從外源DNA捕獲的片段, 提供免疫記憶。Cas基因編碼與CRISPR序列共同作用的蛋白, 包括Cas1到Cas10, CRISPR/Cas系統(tǒng)分為兩類: 多蛋白復(fù)合物的第一類(I、III、IV型)和依賴單一Cas蛋白的第二類(如II型Cas9和V型Cpf1)。最常用的是CRISPR/Cas9系統(tǒng), 由sgRNA和Cas9蛋白組成, sgRNA識別PAM序列, 激活Cas9切割DNA, 導(dǎo)致雙鏈斷裂, 通過NHEJ或HDR修復(fù)。Cas9蛋白和sgRNA可以共編碼到同一pDNA中、作為mRNA或核糖核蛋白復(fù)合物(ribonucleoprotein complex, RNP)使用。例如, Park等利用RNP結(jié)合兩親性R7L10肽, 靶向神經(jīng)元中的BACE1基因, 降低β淀粉樣斑塊(β-amyloid plaques, Aβ) 42分泌, 用于治療AD。盡管CRISPR/Cas9技術(shù)在疾病模型開發(fā)和遺傳病治療方面具有良好的應(yīng)用前景，但可能導(dǎo)致正?；蚬δ艿钠茐幕?qū)е禄蚪M不穩(wěn)定的脫靶效應(yīng)仍然是一個(gè)嚴(yán)重的問題。

1.7 適配體

適配體是完全人工設(shè)計(jì)和合成的單鏈DNA或RNA寡核苷酸, 具有特定的三維結(jié)構(gòu), 通過氫鍵、靜電相互作用和范德華力與目標(biāo)分子相互作用。大多數(shù)適配體通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)篩選得到。與其他以核酸為基礎(chǔ)的療法不同, 適配體不僅通過互補(bǔ)堿基配對識別特定靶標(biāo)序列, 還可以形成三維二級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)相互作用來實(shí)現(xiàn)靶向。通過阻斷關(guān)鍵分子、誘導(dǎo)降解、遞送藥物、調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)等多種方式, 它們能夠有效調(diào)控生物過程, 干預(yù)疾病進(jìn)程(圖1E)。適配體藥物在抗癌、抗病毒、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域展示了廣泛的應(yīng)用潛力, 且具有高特異性、低免疫原性和易于修飾等優(yōu)勢。Cheng等開發(fā)了靶向適配體并探索其殺死膠質(zhì)瘤細(xì)胞的機(jī)制。研究表明, AS1411與膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達(dá)的核仁素結(jié)合, 誘導(dǎo)p53上調(diào)和Bcl-2下調(diào), 隨后引發(fā)細(xì)胞凋亡和周期停滯, 展示了其在膠質(zhì)瘤治療中的潛力。由于其特殊結(jié)構(gòu), 適配體還可以用作靶向配體。例如, AS1411與透明質(zhì)酸雙功能化的微乳劑可穿透BBB, 靶向膠質(zhì)瘤并遞送shikonin和docetaxel。這種制劑能夠選擇性地在U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中積累, 抑制腫瘤生長和癌癥干細(xì)胞的形成。然而, 體內(nèi)穩(wěn)定性和遞送效率仍是其進(jìn)一步發(fā)展的挑戰(zhàn)。

與傳統(tǒng)的小分子和蛋白質(zhì)藥物相比, 核酸藥物在治療靶點(diǎn)范圍和靶點(diǎn)特異性方面表現(xiàn)出更顯著的優(yōu)勢, 且其治療效果通常更為持久。截至目前, 在核酸藥物開發(fā)領(lǐng)域, 已有9款A(yù)SOs、6款siRNA、2款mRNA疫苗和2款RNA適配體藥物獲得批準(zhǔn)上市。其中nusinersen可以糾正SMN基因的剪接缺陷, 增加SMN蛋白的產(chǎn)生, 進(jìn)而改善SMA患者的神經(jīng)系統(tǒng)功能和運(yùn)動(dòng)能力, 而tofersen則用于治療由SOD1基因突變引起的肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)。如表1所示, 還有多款針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的核酸藥物正在臨床試驗(yàn)階段, 進(jìn)一步證明了核酸藥物在這個(gè)治療領(lǐng)域中的巨大潛力。

 

2核酸藥物腦部遞送遇到的障礙

基于RNA或DNA的基因治療及基于CRISPR的治療性基因組編輯雖然為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了潛在的希望, 但核酸類藥物遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過程中面臨著多重生理屏障的挑戰(zhàn)。這些障礙包括循環(huán)系統(tǒng)中的降解和清除、BBB、細(xì)胞攝取效率、內(nèi)體/溶酶體屏障及藥物釋放等問題, 這些因素共同制約了核酸藥物向大腦的有效遞送(圖2A~E)。

Figure 2 Challenges, methods, and mechanisms of nucleic acid drug delivery across the BBB. A−E: Barriers encountered in the brain delivery process of nucleic acid drugs; F: Different administration methods; G: Different mechanisms of crossing the BBB.

2.1 循環(huán)中的降解與清除

經(jīng)靜脈給藥后, 核酸藥物隨血液循環(huán)分布至全身(圖2A), 在此過程中, 核酸藥物在體內(nèi)的清除途徑和生物分布表現(xiàn)出明顯的尺寸依賴性。具體而言, 小于6nm的核酸藥物制劑主要通過腎小球?yàn)V過單元被迅速清除; 而中等尺寸的制劑(20~150nm)則傾向于在肝臟中被單核巨噬細(xì)胞(mononuclear phagocyte, MPS)捕獲并清除。MPS由一系列細(xì)胞組成, 包括肝竇內(nèi)皮細(xì)胞及庫普弗細(xì)胞, 其中庫普弗細(xì)胞作為常駐的巨噬細(xì)胞, 具有強(qiáng)大的吞噬能力, 它們與內(nèi)皮細(xì)胞共同作用，能夠捕獲并清除肝臟中超過90%的核酸藥物。而超過200nm的核酸制劑對MPS的清除具有較高的抵抗力, 并會在肝臟、脾臟和肺部積累。

血液循環(huán)中的核酸藥物制劑與血漿蛋白之間的非特異性結(jié)合對其體內(nèi)分布和治療效果構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。核酸因其固有的負(fù)電荷, 易于與血漿蛋白(例如白蛋白和球蛋白)非特異性結(jié)合。這種非特異性結(jié)合可能會降低藥物的有效濃度, 并加速藥物在體內(nèi)的清除過程。此外, 將核酸藥物封裝在納米載體中進(jìn)行遞送時(shí), 這些載體在血液循環(huán)中也會吸附血漿蛋白形成蛋白冠。蛋白冠的形成會改變納米載體的表面特性, 包括化學(xué)組成、電荷和親疏水性, 進(jìn)而影響其在體內(nèi)的分布、細(xì)胞攝取及免疫反應(yīng)。而這尤其影響核酸藥物腦部遞送常采用“主動(dòng)靶向”策略的納米載體。這類載體表面常設(shè)計(jì)有小分子、肽段和抗體片段等配體以提高其腦靶向能力, 而其表面特性的改變可能會通過電荷特異性或分子間的相互作用進(jìn)一步促進(jìn)蛋白冠的形成, 由于冠層掩蓋了靶向配體, 納米載體的組織歸巢效率會大幅下降。例如, Salvati等發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的聚乙二醇化二氧化硅納米粒子經(jīng)胎牛血清處理后在表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的腫瘤細(xì)胞中的攝取減少, 靶向性降低。但在無血清培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液中, 它們能高效地通過轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被細(xì)胞攝取。

由此可見, 核酸藥物制劑在體內(nèi)應(yīng)盡量避免核酸酶降解、肝臟和腎臟快速清除及與血漿蛋白的非特異性結(jié)合, 才能維持其穩(wěn)定性和療效。此外, 進(jìn)一步優(yōu)化納米載體的設(shè)計(jì), 以減少蛋白冠的形成并保持其靶向配體的活性, 對于提高核酸藥物在腦部的遞送效率至關(guān)重要。

2.2 血腦屏障

BBB是一種具有高度選擇性的半透膜結(jié)構(gòu), 通過將血液與大腦細(xì)胞外液隔離來維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定, 對大腦起著至關(guān)重要的保護(hù)作用。其結(jié)構(gòu)主要由腦血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)、基底膜(basement membrane)、周細(xì)胞(pericyte)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)的終足(end foot)組成(圖2G)。作為BBB的核心結(jié)構(gòu), ECs構(gòu)成腦血管內(nèi)層, 通過細(xì)胞間緊密連接限制水溶性及大分子物質(zhì)通過, 并表達(dá)特殊轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來調(diào)控物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。周細(xì)胞環(huán)繞毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞, 嵌入基底膜, 參與調(diào)控腦血流量與BBB通透性。星形膠質(zhì)細(xì)胞的末梢環(huán)繞腦血管, 經(jīng)終足連基底膜, 其確切作用雖存爭議, 但目前公認(rèn)它能與內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞共同維持BBB功能。基底膜位于上述細(xì)胞之間, 為鄰近的細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)與功能支持, 還能通過與細(xì)胞表面受體作用調(diào)節(jié)細(xì)胞行為與信號傳導(dǎo)。上述組成部分協(xié)同構(gòu)成高選擇性屏障, 既保障必需物質(zhì)進(jìn)入, 又阻擋了有害物質(zhì), 但也給核酸藥物入腦帶來挑戰(zhàn)。BBB阻礙了98%小分子(<500Da)及幾乎所有大分子(>1kDa)神經(jīng)治療藥物的穿透, 極大地增加了中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療難度, 因此開發(fā)能夠有效突破BBB的遞送策略成為當(dāng)前研究的重要方向。

2.3 進(jìn)入靶細(xì)胞

當(dāng)核酸藥物達(dá)到目標(biāo)細(xì)胞的表面, 首先需要進(jìn)入細(xì)胞(圖2C)。核酸藥物進(jìn)入靶細(xì)胞的主要途徑有吞噬作用、巨胞飲作用、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩依賴性內(nèi)吞作用、網(wǎng)格蛋白/小窩非依賴性內(nèi)吞作用等。由于其分子質(zhì)量大且?guī)ж?fù)電, 核酸藥物難以直接穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞, 為了提高細(xì)胞攝取效率和逃避內(nèi)體/溶酶體的降解, 研究人員開發(fā)了多種遞送方法。一方面通過化學(xué)修飾, 如2' O-甲基化、硫代磷酸酯修飾等, 可以提高核酸藥物的穩(wěn)定性和細(xì)胞膜滲透性; 另一方面, 利用納米載體可以實(shí)現(xiàn)核酸藥物的精確靶向和目標(biāo)細(xì)胞對其的高效攝取。通過將核酸藥物包裹在納米載體顆粒中, 以提高其穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取能力, 同時(shí)通過表面修飾配體(主要是小分子與肽)與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合精準(zhǔn)靶向病變細(xì)胞, 用更少的劑量獲得有效的治療效果并減少不良反應(yīng)。例如, 葉酸是一種典型的小分子配體, 它能夠與腫瘤細(xì)胞膜上高度表達(dá)的葉酸受體特異性結(jié)合, 常用于治療腦腫瘤。甘露糖修飾的載體可以與小膠質(zhì)細(xì)胞上的甘露糖受體結(jié)合, Tet1肽(HLNILSTLWKYR)對神經(jīng)元上的三唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂具有高親和力, 這使得它們成為治療神經(jīng)退行性疾病的有力工具。

2.4 內(nèi)體/溶酶體屏障

核酸藥物及其納米載體經(jīng)細(xì)胞攝取后通常會經(jīng)過內(nèi)體/溶酶體途徑(圖2D), 由于溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境(pH4~5)和降解酶, 核酸藥物易發(fā)生降解, 轉(zhuǎn)染效率降低。目前主要有3種方法克服內(nèi)體/溶酶體屏障, 包括被動(dòng)地破裂內(nèi)體/溶酶體、主動(dòng)誘導(dǎo)內(nèi)體/溶酶體結(jié)構(gòu)變化, 以及在內(nèi)吞作用過程中繞過內(nèi)體/溶酶體途徑。

利用質(zhì)子海綿效應(yīng)來促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/溶酶體破裂是核酸藥物遞送中的一種常見的逃逸策略。含有伯胺、仲胺和叔胺等堿性基團(tuán)的聚合物能夠吸附氫質(zhì)子, 從而顯著增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/溶酶體內(nèi)的滲透壓, 導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/溶酶體吸水膨脹并破裂, 釋放出藥物制劑。富含伯胺、仲胺和叔胺基團(tuán)的聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)是最典型的具有質(zhì)子海綿效應(yīng)的聚合物, 被廣泛用于遞送核酸藥物, 然而, 使用PEI時(shí)也需注意其潛在的毒性問題。除了PEI, 其他多種陽離子聚合物也被用于促進(jìn)核酸藥物的傳遞并幫助其從內(nèi)體/溶酶體中逃逸, 例如聚賴氨酸(含伯胺)、聚(L-組氨酸)(含咪唑基團(tuán))、聚精氨酸(含伯胺和仲胺)及聚(β-氨基酯)(含叔胺)?？袢〔《咎堑鞍纂?rabies virus glycoprotein peptide, RVG) 29-9R肽是一種通過在RVG29分子的羧基末端添加含有9個(gè)精氨酸殘基構(gòu)建而成的, 它能夠攜帶核酸藥物, 并通過質(zhì)子海綿效應(yīng)促進(jìn)內(nèi)體/溶酶體的逃逸, 同時(shí)保持RVG29的原有功能不受影響。這些研究進(jìn)展為核酸藥物的遞送提供了新的思路和方法。

目前也有多種載體的逃逸機(jī)制是通過與內(nèi)體/溶酶體的相互作用誘導(dǎo)其結(jié)構(gòu)破壞。Shi等通過將疏水性光敏劑TBD與聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)修飾, 合成了一種兩親性聚合物TBD-PEG-N3。該聚合物能夠自組裝為聚合物納米顆粒, 并通過點(diǎn)擊化學(xué)與二苯并環(huán)辛炔修飾的ASO結(jié)合。在光照條件下, 光敏劑TBD產(chǎn)生大量單線態(tài)氧, 破壞內(nèi)體/溶酶體的結(jié)構(gòu), 促進(jìn)藥物的釋放。在常用的脂質(zhì)納米顆粒核酸遞送系統(tǒng)中, 陽離子脂質(zhì)被認(rèn)為與內(nèi)體逃逸密切相關(guān)。陽離子脂質(zhì)一般是由一個(gè)極性頭部通過連接子和疏水的尾巴相連接。目前新一代的陽離子脂質(zhì)包含了可降解的可離子化脂質(zhì), 其pKa值一般在6.0~7.0之間, 在生理?xiàng)l件下呈現(xiàn)電中性。當(dāng)進(jìn)入內(nèi)體的酸性環(huán)境時(shí), 可離子化脂質(zhì)的頭部會被質(zhì)子化, 帶上正電荷, 與內(nèi)體膜上的陰離子脂質(zhì)相互作用, 這一過程促使脂質(zhì)體形成反六角相結(jié)構(gòu), 通過膜融合或膜破裂釋放有效載荷進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。

近年來, 能夠繞過內(nèi)體/溶酶體途徑的細(xì)胞攝取方式引起了廣泛關(guān)注, 其中外泌體包裹可以通過膜融合介導(dǎo)載體的攝取, 從而繞過內(nèi)體/溶酶體途徑。研究發(fā)現(xiàn), 直徑40~100nm的突觸小泡(一種脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu))能通過與質(zhì)膜融合來釋放神經(jīng)遞質(zhì)和激素, 這一過程主要由可溶性N-乙基馬來酰胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors, SNAREs)蛋白介導(dǎo); 通過將SNAREs來源的跨膜片段syb(TMS-syb)插入人工脂質(zhì)雙層, 成功模擬了突觸小泡的膜融合功能, 促進(jìn)載體通過膜融合進(jìn)入神經(jīng)元, 繞過了內(nèi)體/溶酶體途徑。You團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)由33個(gè)氨基酸組成的多肽pardaxin能夠介導(dǎo)脂質(zhì)體通過小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞并靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 不僅避免了核酸藥物在內(nèi)質(zhì)體/溶酶體中被核酸酶降解, 還有利于pDNA或CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行基因治療。

2.5 藥物釋放

核酸藥物通常在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中發(fā)揮作用, 其從載體上有效釋放是其發(fā)揮作用的前提。內(nèi)體/溶酶體中的酸性微環(huán)境可以作為內(nèi)源性刺激來促進(jìn)核酸藥物釋放。Zhou等合成了(DPAx-co-DMAEMAy)-PG三嵌段pH敏感多聚陽離子, 將其組裝成膠束并通過靜電吸附siRNA。在酸性條件下, DPA由于質(zhì)子化從疏水性轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性, 促使膠束降解并釋放siRNA。細(xì)胞內(nèi)的各種酶也是藥物釋放的理想內(nèi)源性刺激。例如酯酶就是一種廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中的水解酶, 可以通過催化酯鍵的水解來介導(dǎo)化學(xué)藥物的釋放。在腦腫瘤細(xì)胞質(zhì)中特異性高表達(dá)的谷胱甘肽(glutathione, GSH)可以通過還原效應(yīng)促進(jìn)核酸藥物的釋放。Wu等合成了對GSH敏感的嵌段共聚物, 通過GSH介導(dǎo)的二硫鍵斷裂, 促進(jìn)了藥物的釋放。腫瘤和神經(jīng)退行性疾病中活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平升高, 可以利用這一特點(diǎn)來刺激藥物的釋放。例如Liu等合成了帶有苯硼酸的正負(fù)電荷轉(zhuǎn)換聚合物, ROS可以降解苯硼酸, 從而將聚合物轉(zhuǎn)化為聚丙烯酸, 通過靜電排斥釋放DNA。此外, 通過膜融合直接將核酸藥物釋放到細(xì)胞質(zhì)中也是一種高效且簡便的遞送策略。載體與細(xì)胞膜的直接相互作用是其核心機(jī)制, 通常通過電荷作用(載體通常帶有陽離子, 可以與帶負(fù)電的細(xì)胞膜相互吸引)或疏水性相互作用來觸發(fā)載體膜與細(xì)胞膜之間的相互作用, 促使磷脂雙層的重排和融合, 從而在無需進(jìn)入內(nèi)體/溶酶體的情況下釋放核酸藥物至細(xì)胞質(zhì)。這種方法可以避免核酸藥物在內(nèi)體/溶酶體內(nèi)被核酸酶降解的風(fēng)險(xiǎn), 提高了其在靶細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性和有效性。

 

3核酸藥物腦部遞送的途徑及其機(jī)制

3.1 繞過BBB的方式

3.1.1 鞘內(nèi)注射和腦室內(nèi)注射給藥

藥物中樞遞送的最直接方法是將藥物注射到腦脊液中。這種方式可繞過BBB, 提高藥物在大腦中的濃度并減少全身不良反應(yīng), 主要的給藥方式有鞘內(nèi)注射(intrathecal, IT)和腦室內(nèi)注射(intracerebroventricular, ICV)。IT給藥通過腰椎穿刺或植入鞘內(nèi)藥物遞送裝置進(jìn)行, 將藥物注入脊髓周圍的鞘內(nèi)或蛛網(wǎng)膜下腔, 這種方法有助于藥物分布到脊髓、小腦和大腦表面, 是治療神經(jīng)和神經(jīng)肌肉疾病的ASO/siRNA最常用的給藥途徑。ICV給藥則是通過穿過顱骨將藥物注射到側(cè)腦室, 藥物通過腦脊液循環(huán)分布于整個(gè)大腦。兩種給藥方式廣泛應(yīng)用于需要高濃度藥物在腦內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療, 如腦腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等。

Nusinersen和tofersen是兩種已獲FDA批準(zhǔn)的小核酸藥物, 均采用IT給藥的方式。它們屬于ASOs, 具有單鏈結(jié)構(gòu), 并在磷酸骨架中富含磷酸硫代(phosphorothioate, PS)修飾。PS修飾提高了寡核苷酸的穩(wěn)定性和親脂性, 使其具有跨越細(xì)胞膜的能力, 增強(qiáng)了其在體內(nèi)的分布和生物利用度。siRNA相比ASOs更為親水, 并帶有較多負(fù)電荷, 直接跨膜能力較弱, 需要通過化學(xué)手段提高其疏水性以用于局部注射。Alnylam公司的ALN-APP(alnylam amyloid precursor protein)是這一技術(shù)的代表分子。近期, 該公司公布了通過IT給藥ALN-APP治療AD和腦淀粉樣血管病(cerebral amyloid angiopathy, CAA)的I期臨床試驗(yàn)的中期結(jié)果。ALN-APP采用C16脂肪酸鏈偶聯(lián)的方式, 增加了siRNA的疏水性, 輔助其跨越細(xì)胞膜, 從而發(fā)揮沉默靶基因的作用。APP基因的突變是導(dǎo)致早發(fā)性阿爾茨海默病和腦淀粉樣血管病的重要原因, 且淀粉樣蛋白沉積是阿爾茨海默病患者大腦的標(biāo)志性特征之一。通過靶向編碼APP蛋白的mRNA, ALN-APP旨在降解mRNA, 減少APP蛋白的表達(dá), 從而治療AD和CAA。初步結(jié)果顯示, 單劑量ALN-APP能在患者體內(nèi)快速結(jié)合靶標(biāo), 并持續(xù)降低sAPPα和sAPPβ水平超過6個(gè)月。

3.1.2 鼻內(nèi)給藥

與IT和ICV相比, 鼻內(nèi)給藥(intranasally, IN)是一種非侵入性途徑, 主要通過嗅覺神經(jīng)和三叉神經(jīng)通路, 避開BBB將核酸藥物直接遞送到大腦。其中, 嗅覺神經(jīng)是最重要的途徑, 利用其傳輸功能可有效繞過BBB。嗅覺通路主要以神經(jīng)元外(神經(jīng)細(xì)胞外間隙)轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)元內(nèi)(軸突內(nèi))轉(zhuǎn)運(yùn)兩種方式將藥物遞送到CNS。前者是通過藥物在嗅覺神經(jīng)束的細(xì)胞外間隙的擴(kuò)散來實(shí)現(xiàn)的, 藥物分子可以在鼻黏膜上皮通過細(xì)胞外途徑進(jìn)入, 然后通過嗅球進(jìn)入大腦, 這種轉(zhuǎn)運(yùn)方式的速度較快, 可以在幾分鐘到半小時(shí)內(nèi)完成。后者則涉及藥物通過被動(dòng)擴(kuò)散、吸附性內(nèi)吞和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞等細(xì)胞內(nèi)機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞, 通過嗅覺神經(jīng)元的軸突進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。藥物分子在與嗅覺上皮的嗅覺感受神經(jīng)元結(jié)合后, 可以沿著神經(jīng)元的軸突進(jìn)入大腦, 最終到達(dá)嗅球和其他腦區(qū), 這種轉(zhuǎn)運(yùn)方式的速度較慢, 可能需要數(shù)小時(shí)到數(shù)天。一旦藥物到達(dá)嗅球和腦脊液, 它們可以通過與腦細(xì)胞外液的混合進(jìn)入CNS的其他區(qū)域。

三叉神經(jīng)通路是實(shí)現(xiàn)鼻−腦藥物遞送的另一種途徑。藥物可以通過這一通路穿過呼吸和嗅覺上皮, 通過細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的運(yùn)輸機(jī)制沿三叉神經(jīng)進(jìn)入大腦。這種方式可以快速實(shí)現(xiàn)藥物從鼻腔到大腦的靶向治療。此外, 藥物還可以通過血液循環(huán)通路進(jìn)入CNS。

具體來說, 藥物可以通過鼻腔黏液層、鼻上皮細(xì)胞層進(jìn)入靜脈血流, 隨后穿透BBB進(jìn)入CNS。經(jīng)鼻給藥可快速直接進(jìn)入CNS, 減少藥物在血液循環(huán)中的延遲和清除, 降低非靶向器官(如肝臟、脾臟和腎臟)的毒性風(fēng)險(xiǎn)。Rohn等通過非侵入性鼻腔遞送腺相關(guān)病毒9型(adeno-associated virus serotype9, AAV9)載體, 繞過BBB, 將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)導(dǎo)入小鼠CNS, 成功下調(diào)了HTR2A基因表達(dá), 顯著減少5HT-2A受體的表達(dá), 改善了小鼠的焦慮行為。

目前, 鼻內(nèi)給藥也存在一些挑戰(zhàn): 需要最大化CNS滲透并最小化肺部暴露; 鼻纖毛的清除和酶活性會限制藥物在鼻腔中的停留時(shí)間和穩(wěn)定性; 未修飾的核酸藥物易被鼻腔中的核酸酶降解或引發(fā)免疫反應(yīng); 鼻腔遞送只能進(jìn)行低劑量給藥, 需要頻繁滴入; 存在劑量變化和個(gè)體吸收特性的差異等。為了克服這些挑戰(zhàn), 研究者們正在探索納米載體的表面修飾和化學(xué)修飾, 以提高藥物的靶向遞送效率和內(nèi)體逃逸能力。相關(guān)研究表明, 提高內(nèi)體逃逸效率可以增加核苷酸藥物在細(xì)胞質(zhì)中的濃度。盡管存在一些限制, 鼻腔給藥途徑憑借其直接的鼻腦轉(zhuǎn)運(yùn)通路、豐富的血管分布、多孔的內(nèi)皮基底膜及能夠繞過肝臟首過效應(yīng)等優(yōu)勢, 顯示出較高的臨床應(yīng)用潛力。

3.1.3 對流增強(qiáng)遞送

對流增強(qiáng)遞送(convection-enhanced delivery, CED)是一種用于將藥物直接遞送到腦組織中的局部給藥技術(shù)。該方法通過在壓力梯度下持續(xù)注射藥物, 使藥物通過細(xì)胞間的空隙進(jìn)入大腦組織, 從而繞過BBB, 實(shí)現(xiàn)高效的局部藥物遞送。Cohen等采用CED技術(shù), 通過顱內(nèi)注射(intracranial injection, IC)將透明質(zhì)酸修飾的脂質(zhì)納米顆粒直接遞送到腦部腫瘤位置。這些納米顆粒包裹著靶向PLK1基因的siRNA, 能夠選擇性結(jié)合腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)的CD44受體, 從而實(shí)現(xiàn)特異性靶向作用。通過CED, 藥物可以繞過BBB, 在腫瘤部位形成高濃度藥物分布, 有效抑制PLK1表達(dá), 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤生長。

3.2 克服血腦屏障

3.2.1 物理方法

聚焦超聲(focused ultrasound, FUS)結(jié)合微氣泡(microbubble, MB)技術(shù)是一種非侵入性的物理手段。該技術(shù)通過將低頻超聲能量聚焦于特定腦區(qū), 與預(yù)先注入血液循環(huán)中的MB協(xié)同作用, 短暫且局部地打開BBB。在超聲波的作用下, MB發(fā)生振蕩, 產(chǎn)生機(jī)械力作用于內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接, 在約1~4h內(nèi)創(chuàng)建一個(gè)藥物遞送窗口, 窗口在約24h后恢復(fù)。該過程能夠在不破壞神經(jīng)組織的前提下, 促進(jìn)核酸藥物的局部滲透。該方法的優(yōu)勢在于其空間分辨率高, 可精確定位于目標(biāo)腦區(qū), 且BBB的打開是可逆的。Guo等探討了微氣泡增強(qiáng)的聚焦超聲(FUS-MB)結(jié)合50nm大小的陽離子脂質(zhì)−聚合物混合納米顆粒能高效遞送siRNA到腦腫瘤微環(huán)境中, 顯著抑制Smoothened蛋白的表達(dá), 并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Kwak等通過FUS-MB暫時(shí)性地打開BBB, 使系統(tǒng)性注射的納米顆粒穿過BBB并精準(zhǔn)遞送至目標(biāo)腦區(qū)。研究中使用的聚(b-氨基酯)納米顆粒經(jīng)過表面修飾, 能夠穩(wěn)定包裹核酸藥物(如pDNA和mRNA), 并在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中實(shí)現(xiàn)報(bào)告蛋白表達(dá)和CRISPR/Cas9基因編輯。同時(shí)磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)可以提供精確定位, MRI引導(dǎo)的FUS-MB能夠精確打開腫瘤和紋狀體區(qū)域的血腦屏障, 分別應(yīng)用于治療膠質(zhì)瘤和帕金森病。然而, FUS-MB可能因增加局部溫度及機(jī)械效應(yīng)而損傷血管, 并允許有毒物質(zhì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng), 因此需優(yōu)化FUS參數(shù)以減少腦損傷。超短脈沖激光也能通過類似原理局部打開BBB且不破壞血管完整性。全腦高溫療法雖能提高BBB通透性, 但可能會對大腦造成嚴(yán)重的傷害, 包括細(xì)胞損傷和功能障礙, 具有潛在的嚴(yán)重不良反應(yīng)和風(fēng)險(xiǎn)。

電穿孔技術(shù)通過在BBB上施加短暫的高強(qiáng)度電場, 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞膜極化, 形成微小孔洞, 瞬時(shí)提高血腦屏障的通透性, 使得治療性核酸能夠進(jìn)入腦組織, 促進(jìn)核酸藥物的腦部遞送。更強(qiáng)、更長的電脈沖可以形成更多的孔, 從而得到更高的轉(zhuǎn)染速率, 但是這也可能導(dǎo)致外部介質(zhì)擴(kuò)散到細(xì)胞中, 增加毒性, 進(jìn)而引起細(xì)胞死亡、組織損傷和炎癥反應(yīng)等不良反應(yīng)。因此, 在應(yīng)用電穿孔技術(shù)時(shí), 需要精確控制電場強(qiáng)度和脈沖時(shí)間等參數(shù), 以平衡轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞損傷。

3.2.2 化學(xué)方法

此外, 一些生物和化學(xué)物質(zhì)(如封閉帶毒素、組胺、緩激肽、油酸等)也可暫時(shí)打開BBB。Lexiscan是一種能夠短暫增強(qiáng)BBB通透性的化學(xué)物質(zhì), 它通過結(jié)合并激活血管內(nèi)皮細(xì)胞上的腺苷A2A受體, 引起血管擴(kuò)張并增加局部血流量, 暫時(shí)性地松解血腦屏障的緊密連接。這種機(jī)制使得血腦屏障的通透性短暫增強(qiáng), 使大分子藥物或納米顆粒能夠更容易穿越屏障, 進(jìn)入腦組織進(jìn)行治療。Lexiscan的作用是短暫且可逆的, 能夠增加藥物在腦部靶向區(qū)域的滲透和累積, 尤其在腦腫瘤(如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)的治療中, 顯著提高了遞送效率。

3.3 跨越BBB

親脂性藥物和一些特殊設(shè)計(jì)的藥物可通過跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑穿過BBB。這包括通過血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)吞作用、囊泡運(yùn)輸和外排作用等?？缂?xì)胞途徑允許藥物直接穿過細(xì)胞膜, 是一種更為有效的藥物遞送方式, 具有更大的潛力。它可分為3個(gè)不同的類別: 受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)(receptor-mediated transcytosis, RMT)、載體蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)(carrier-mediated transcytosis, CMT)和吸收介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)(adsorptive-mediated transcytosis, AMT)。RMT通過特定受體介導(dǎo)的通路進(jìn)行核酸藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)。跨越BBB的RMT過程需要配體與其在腦微血管和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腔膜上的同源受體結(jié)合, 并確保靶受體蛋白在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá), 而在外周血管中最低表達(dá), 從而實(shí)現(xiàn)藥物的有效遞送。CMT通過特定的膜載體蛋白介導(dǎo)核酸藥物跨BBB轉(zhuǎn)運(yùn); 而AMT則通過富含精氨酸或賴氨酸等陽離子氨基酸的細(xì)胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)經(jīng)靜電吸附內(nèi)皮細(xì)胞來增強(qiáng)BBB通透性。

3.3.1 受體介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)

在受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用中, 特定的配體與內(nèi)皮細(xì)胞管腔側(cè)的特異性受體結(jié)合, 觸發(fā)內(nèi)吞作用形成轉(zhuǎn)胞囊泡, 轉(zhuǎn)運(yùn)到大腦。這種方法是研究最廣泛的腦遞送途徑。常見的受體包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(targeting transferrin receptor, TFR)、煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)、胰島素受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein, LRP)等。

3.3.1.1 TFR

TFR在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高度表達(dá), 通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用內(nèi)化轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的鐵。大多數(shù)用于RMT的配體是序列特異性肽, 它們因合成成本低且易于大規(guī)模生產(chǎn)而受到青睞。同時(shí)這些肽還具有氨基、羧基和巰基等反應(yīng)性基團(tuán), 可以在溫和反應(yīng)條件下將其化學(xué)修飾到納米粒子表面。目前已開發(fā)出一種標(biāo)準(zhǔn)的載體修飾肽方法, 即通過Michael加成反應(yīng), 將特定序列肽的半胱氨酸修飾后共價(jià)附著到馬來酰亞胺修飾的納米粒子上。特定序列肽如T7(HAIYPRH)、TBP(GGGHKYLRW)等已被開發(fā)出來, 它們可以通過特異性結(jié)合BBB上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體來增加核酸藥物在大腦中的積累。

靶向BBB上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體還可以通過在納米顆粒表面修飾80kDa的轉(zhuǎn)鐵蛋白來實(shí)現(xiàn)。許多研究表明, 結(jié)合有轉(zhuǎn)鐵蛋白的納米系統(tǒng)能夠通過蛋白受體結(jié)合和隨后轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用有效地穿越BBB, 將藥物遞送到大腦。Rodrigues等開發(fā)了轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的納米系統(tǒng), 用于將核酸治療物遞送至大腦。他們首次開發(fā)了一種雙配體功能化, 與CPP滲透素(penetratin, Pen)和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的脂質(zhì)體載體, 以跨BBB遞送pDNA, 在體外BBB模型(由腦內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3和大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建)中, 雙配體脂質(zhì)體的效率顯著高于單配體脂質(zhì)體(7%對比3%GFP陽性神經(jīng)元)。體內(nèi)研究顯示, 相比于未結(jié)合或單一配體功能化脂質(zhì)體。靜脈注射的雙配體脂質(zhì)體在小鼠大腦中轉(zhuǎn)染效率更高。Rodrigues等后來擴(kuò)展了他們早期的工作, 在小鼠AD模型中測試了這些腦靶向CPP-轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體的治療潛力和有效性, 研究發(fā)現(xiàn), 靜脈注射負(fù)載神經(jīng)生長因子基因pDNA的CPP-轉(zhuǎn)鐵蛋白脂質(zhì)體顯著減少了AD小鼠腦中的Aβ沉積。

3.3.1.2 nAChR

nAChR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)且分布廣泛, 可以利用其相關(guān)的配體通過RMT實(shí)現(xiàn)腦靶向。例如來自狂犬病毒糖蛋白的RVG肽含有29個(gè)氨基酸, 可以結(jié)合腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元上的nAChR。RVG肽可以誘導(dǎo)受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用, 穿透BBB, 最終將生物制劑運(yùn)輸?shù)侥X實(shí)質(zhì), 目前已成功作為靶向大腦的配體, 用于遞送小分子藥物、siRNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行診斷和/或治療, 適用于各種疾病, 如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)、創(chuàng)傷性腦損傷和AD等。

Shen等報(bào)道RVG肽能夠促進(jìn)CRISPR/Cas9遞送至大腦, 他們介紹了一種通過一步合成法構(gòu)建的可追蹤納米生物雜化復(fù)合物(fluorescent traceable biohybrid iron oxide, F-TBIO), 用于AD的CRISPR/Cas9基因編輯與化學(xué)藥物協(xié)同治療。F-TBIO由超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticle, SPION)核心構(gòu)建, 并與聚賴氨酸-PEG連接, 末端為RVG或氟伐他汀。這些納米系統(tǒng)能夠穿越BBB并靶向神經(jīng)元, 有效遞送CRISPR/Cas9基因編輯器和藥物。體內(nèi)研究表明, 該系統(tǒng)可以顯著減少AD小鼠海馬體中的Ab斑塊面積, 并改善其認(rèn)知能力。同時(shí), F-TBIO具有良好的MRI成像性能, 能在復(fù)雜的腦生理環(huán)境中提供準(zhǔn)確的成像信號, 展示了其作為神經(jīng)退行性疾病治療平臺的巨大潛力。

3.3.1.3 LRP

LRP(如LRP1和LRP2)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(包括腦內(nèi)皮細(xì)胞和GBM細(xì)胞)中高度表達(dá), 介導(dǎo)的多種配體[包括載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)和某些神經(jīng)保護(hù)因子], 被廣泛用于研究神經(jīng)退行性疾病的藥物遞送。Angiopep-2(Ang, TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC)是靶向LRP1的最具代表性的肽, 其序列是基于阿普羅汀及其他具有Kunitz型結(jié)構(gòu)域的LRP1結(jié)合蛋白的序列比對而設(shè)計(jì)的。Angiopep-2能夠促進(jìn)藥物穿越BBB并靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞, 已被廣泛應(yīng)用于治療GBM。Zou等研究開發(fā)了一種高效封裝CRISPR/Cas9的納米膠囊, 通過系統(tǒng)給藥實(shí)現(xiàn)對GBM的非侵入性靶向治療。這些納米膠囊采用原位聚合方法, 在GSH降解的聚合物殼內(nèi)封裝Cas9/sgRNA RNP, 通過使用Angiopep-2肽作為靶向配體, Cas9RNP納米膠囊在GBM小鼠模型中展現(xiàn)了明顯的腫瘤靶向能力(11.8%ID·g-1)和高效的PLK1基因編輯效果(Sanger測序顯示28.6%的插入/缺失率), 將攜帶腫瘤小鼠的中位生存時(shí)間從24天延長至68天。此外, Angiopep-2肽的修飾使納米顆粒能夠高效穿越BBB并在腦腫瘤中積累(12.9%ID·g-1)。在GBM小鼠模型中, Cas9介導(dǎo)的PLK1基因敲除有效抑制了腫瘤生長, 將小鼠的中位生存時(shí)間從18天(PBS處理)延長至40天, 同時(shí)幾乎沒有不良反應(yīng)。

3.3.2 載體蛋白介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)

CMT是通過特定的膜載體蛋白在逆濃度梯度中將藥物運(yùn)過BBB。BBB內(nèi)皮細(xì)胞含有多種特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter type1, GLUT1)、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(L-type amino acid transporter1, LAT1)、核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等神經(jīng)遞質(zhì)、維生素和脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常位于內(nèi)皮細(xì)胞的頂端和基底側(cè)膜上。藥物被設(shè)計(jì)成類似于這些天然底物(如葡萄糖、氨基酸等)的分子, 這樣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠識別并結(jié)合這些藥物分子。當(dāng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白識別并結(jié)合藥物分子以后, 其構(gòu)象會發(fā)生變化, 能夠?qū)⑺幬飶难阂粋?cè)轉(zhuǎn)運(yùn)到腦內(nèi)一側(cè)。由此可見改變納米顆粒上的某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其類似物是增加納米顆粒BBB滲透性的有效方法。

GLUT1是一種己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Na離子濃度差異驅(qū)動(dòng)D-葡萄糖、L-抗壞血酸及其衍生物通過GLUT1從血液轉(zhuǎn)運(yùn)到大腦。Zhou等開發(fā)了一種半乳糖修飾的兩親性聚合物膠束系統(tǒng)包載siRNA藥物(Gal-NP@siRNA), 該系統(tǒng)通過血糖控制的GLUT1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)高效穿越BBB。研究表明, Gal-NP@siRNA系統(tǒng)在AD小鼠模型中顯著降低了BACE1的表達(dá), 減少了淀粉樣斑塊, 并改善了認(rèn)知功能, 同時(shí)未顯示出顯著的不良反應(yīng), 展示了其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的巨大潛力。

3.3.3 吸附介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)

AMT提供了一種通過細(xì)胞吸附和胞吞作用將物質(zhì)跨越BBB向大腦遞送藥物的方法。其相關(guān)機(jī)制是帶正電的蛋白質(zhì)、肽或分子與BBB細(xì)胞內(nèi)腔側(cè)的負(fù)電糖萼和細(xì)胞膜發(fā)生靜電相互作用, 觸發(fā)內(nèi)吞作用, 形成跨胞吞噬小泡。這些小泡移動(dòng)到BBB細(xì)胞的外腔膜, 融合并釋放分子進(jìn)入大腦。

富含陽離子氨基酸(如精氨酸或賴氨酸)的CPPs可通過與內(nèi)皮細(xì)胞的靜電吸附增強(qiáng)BBB的通透性。Yao等研究了一種新型基因遞送系統(tǒng)，用于BBB治療膠質(zhì)瘤。該系統(tǒng)基于樹枝狀聚賴氨酸(dendrigraft poly-L-lysines, DGL)和PEG結(jié)合的細(xì)胞穿透肽(LIM kinase2nucleolar translocation peptide, LNP) LIM激酶2核仁轉(zhuǎn)運(yùn)信號序列?；蛑委熭d體(DGL-PEG-LNP)封裝了編碼生長抑制因子基因的pDNA。研究結(jié)果表明, 該遞送系統(tǒng)能夠有效穿越BBB, 增強(qiáng)細(xì)胞攝取, 并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)。LNP修飾的納米顆粒(DGL-PEG-LNP/DNA)在膠質(zhì)瘤小鼠模型中顯示出顯著的腫瘤細(xì)胞凋亡效果, 并且與其他治療相比, 顯著延長了膠質(zhì)瘤小鼠的中位生存時(shí)間。Chen等設(shè)計(jì)了用于將CRISPR/Cas9基因組編輯器遞送到大腦的脂質(zhì)體模板水凝膠納米顆粒(liposome-templated hydrogel nanoparticles, LHNPs)。LHNP修飾了iRGD和mHph3CPPs以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)遞送效率, 使其在腦腫瘤中的積累比未修飾的LHNP高出2.6倍。但同時(shí)利用CPPs進(jìn)行修飾可能會促進(jìn)藥物在全身給藥后被不適當(dāng)?shù)募?xì)胞吸收, 從而產(chǎn)生不良反應(yīng)。此外, CPPs的正電荷還可能加速納米顆粒在血液循環(huán)中的清除。因此, 應(yīng)謹(jǐn)慎考慮在全身給藥中應(yīng)用CPPs。

 

4核酸藥物的腦部遞送策略及其應(yīng)用

核酸藥物的強(qiáng)負(fù)電荷和對核酸酶降解的易感性限制了它們被局灶細(xì)胞吸收, 臨床應(yīng)用面臨穩(wěn)定性差、靶向性弱、難以跨越體內(nèi)屏障等難題。不同類型的核酸具有不同的分子結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量, 因此需要不同的裝載策略: 小的核酸藥物, 如siRNA、miRNA和ASOs, 可以通過核酸化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾來提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和靶向性, 并與配體分子偶聯(lián)以促進(jìn)其在病灶內(nèi)的積累, 提高遞送效率, 同時(shí)降低藥物的免疫原性; 而分子質(zhì)量相對較大的核酸藥物, 如mRNA和pDNA, 難以進(jìn)行化學(xué)修飾, 易于通過具有較大空間的載體進(jìn)行裝載和體內(nèi)遞送, 目前應(yīng)用較多的遞送載體有病毒載體、聚合物納米載體、脂質(zhì)納米顆粒、無機(jī)納米載體、蛋白載體、外泌體等。這些載體不僅幫助藥物到達(dá)病灶, 還促進(jìn)核酸類藥物實(shí)現(xiàn)更高效的內(nèi)體逃逸, 從而在體內(nèi)更好地發(fā)揮作用。向大腦遞送核酸的理想載體應(yīng)具有生物相容性、穩(wěn)定性和有效的細(xì)胞攝取等特殊特性。穿過血腦屏障的擴(kuò)散主要取決于血腦屏障兩側(cè)藥物的親脂性、表面電荷、相對分子質(zhì)量和濃度梯度。不同載體在核酸藥物腦部遞送方面的應(yīng)用情況如表2所示。

4.1 病毒載體

到目前為止, 已經(jīng)創(chuàng)建了用于全身遞送的病毒和非病毒載體。病毒載體, 包括腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)、腺病毒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和單純皰疹病毒, 已被開發(fā)并用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床前和臨床基因治療。研究發(fā)現(xiàn), 病毒可以通過不同的機(jī)制穿越BBB(圖3A), 如AAV通過與神經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表面蛋白結(jié)合進(jìn)入腦實(shí)質(zhì), 觸發(fā)受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)吞作用, 可以轉(zhuǎn)導(dǎo)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞, 并且能夠在神經(jīng)細(xì)胞中長期表達(dá)。人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)可以感染單核細(xì)胞并利用其作為特洛伊木馬來穿越血腦屏障。BBB外感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是狂犬病毒等病毒的另一入口, 他們結(jié)合神經(jīng)肌肉連接處的神經(jīng)元并利用軸突運(yùn)輸系統(tǒng)進(jìn)行逆行運(yùn)輸?；诖艘呀?jīng)開發(fā)了幾種基于病毒顆粒遞送治療性核酸的方法。2012年歐洲藥品管理局(European Medicines Agency, EMA)批準(zhǔn)了首個(gè)基于AAV方法的基因治療產(chǎn)品Glybera, 展示了AAV載體的理想安全性和巨大應(yīng)用潛力。而第一個(gè)成功治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基于AAV的基因療法是onasemnogene abeparvovec (Zolgensma), 該療法已被FDA批準(zhǔn)用于治療年齡小于2歲的SMA兒童患者(NCT03955679)。

Figure 3 Different types of nucleic acid delivery methods. A: Different pathways of viral vectors entry into CNS. Created in https://www.BioRender.com; B: Modification of nucleic acid drugs; C:The schematic illustrations of the lipid-based nanoparticles[153]. Adapted from Ref. 153 with permission; D: Schematic representation of the structure of nanocapsules and nanospheres (arrow stands for the presence of drug/bioactive within the nanoparticles)[162]. Adapted from Ref. 162 with permission; E: Scheme of exosome biogenesis and secretion (left), molecular constituents of the exosomes (right)[172]. Adapted from Ref. 172 with permission; F: Endogenous loading and exogenous loading of material engineering exosomes[180]. Adapted from Ref. 180 with permission

 

基于病毒的載體目前主要用于基因治療, 并且通常依賴于侵入性遞送(如IT)。這些方法存在一些問題, 包括免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致的藥物降效、病毒載體的安全性風(fēng)險(xiǎn)及對正常細(xì)胞的影響、傳遞效率不穩(wěn)定、生產(chǎn)和規(guī)?；щy, 以及可能引發(fā)基因編輯問題。

4.2 核酸藥物結(jié)構(gòu)改造

通過對核酸藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造, 借助化學(xué)修飾手段將親脂性分子引入核酸主鏈, 或采用配體偶聯(lián)方式將多肽小分子配體等與核酸主鏈相連(圖3B), 可使得到的核酸藥物具有明確且單一的分子結(jié)構(gòu), 顯著增強(qiáng)其穩(wěn)定性, 并有效降低批次間差異。同時(shí)通過這些改造策略提升藥物的細(xì)胞攝取效率及在特定靶組織或細(xì)胞的富集能力, 有利于核酸藥物的臨床轉(zhuǎn)化。

由于小核酸藥物通常帶有負(fù)電荷且極性較強(qiáng), 在穿膜或跨越BBB時(shí)面臨巨大挑戰(zhàn), 通過引入親脂性基團(tuán)可改善核酸藥物的脂溶性, 從而在肝外組織(包括中樞神經(jīng)系統(tǒng))實(shí)現(xiàn)更有效的遞送。例如, Brown等研究發(fā)現(xiàn), 2′-O-十六烷基(C16)修飾的siRNA可在嚙齒類和非人靈長類動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)持續(xù)且高效的基因沉默。在AD小鼠模型中的進(jìn)一步研究表明, C16-siRNA能靶向淀粉樣前體蛋白, 有效改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為及生理缺陷。除十六烷基外, 膽固醇的環(huán)狀結(jié)構(gòu)也常用于核酸修飾, 并被認(rèn)為較直鏈脂肪酸更具親脂性。Nagata等將膽固醇或a-生育酚偶聯(lián)于DNA/RNA異源雙鏈寡核苷酸(heteroduplex oligonucleotides, HDO)后, 通過靜脈或皮下給藥可使其更容易跨越BBB, 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布并實(shí)現(xiàn)對靶基因高達(dá)90%的抑制率, 大大優(yōu)于傳統(tǒng)單鏈ASOs。

在提升細(xì)胞攝取與逃逸效率方面, CPPs帶有正電荷或疏水性基團(tuán), 可增強(qiáng)藥物與細(xì)胞膜的相互作用并促進(jìn)內(nèi)吞, 部分CPP還能在內(nèi)體酸化環(huán)境中破壞或改變內(nèi)體膜結(jié)構(gòu), 實(shí)現(xiàn)內(nèi)體/溶酶體逃逸, 有效避免藥物降解。與此同時(shí), 若偶聯(lián)分子能夠識別并結(jié)合BBB上高表達(dá)的受體, 則可通過RMT將藥物遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Dastpeyman等將CPP HA2-ApoE(131~150)與抗SMA藥物諾西那生(nusinersen)偶聯(lián), 通過HA2-ApoE與LDLR的相互作用觸發(fā)RMT, 實(shí)現(xiàn)腦部遞送, 在SMN2轉(zhuǎn)基因小鼠模型中, 這種偶聯(lián)物通過系統(tǒng)給藥顯著增加了大腦和脊髓中完整SMN2蛋白的水平, 表明了其高效的內(nèi)體逃逸及BBB跨越能力。

此外, 葉酸(folic acid, FA)修飾是典型的小分子配體修飾方式之一, 它在早期神經(jīng)元發(fā)育和分化中起著重要作用, 包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的各種癌細(xì)胞類型, 都表達(dá)高水平的葉酸受體。通過內(nèi)吞作用輔助藥物穿越細(xì)胞膜, 并與腫瘤細(xì)胞或BBB上的葉酸受體結(jié)合, 葉酸修飾可實(shí)現(xiàn)核酸藥物的靶向富集。Lee等構(gòu)建了含有抗miR-21鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)序列的多價(jià)葉酸, 三向結(jié)(three-way-junction, 3WJ) RNA納米粒子, 遞送抗miR-21LNA到膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。通過靜脈注射FA-3WJ-LNA-miR21, 有效地降低了miR-21的表達(dá), 從而恢復(fù)了腫瘤抑制因子PTEN和PDCD4的功能, 使得膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡和腫瘤生長抑制, 顯著提高了小鼠的總體生存率。

綜上可見, 化學(xué)修飾或配體偶聯(lián)后的核酸藥物不僅具備結(jié)構(gòu)可控、成分單一、親脂性可調(diào)等優(yōu)勢, 也能更好地應(yīng)對快速腎臟清除及內(nèi)吞體/溶酶體逃逸等挑戰(zhàn); 若再結(jié)合血腦屏障跨越策略或特異性配體靶向機(jī)制, 則有望進(jìn)一步提高核酸藥物在多種疾病模型中的治療效率和安全性, 為后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

4.3 脂質(zhì)納米顆粒

脂質(zhì)類是核酸藥物遞送中應(yīng)用最廣泛的一類遞送系統(tǒng), 包括脂質(zhì)體(liposome)、脂質(zhì)體復(fù)合物(lipoplex, LP)、脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticle, LNP)等, 目前研究中用得較多的為含有可離子化脂質(zhì)的LNP。LNP一般包括可電離的陽離子磷脂(ionizable lipids)、中性輔助磷脂(helper lipids)、膽固醇、聚乙二醇修飾的磷脂(PEGylated lipid)等4種主要成分(圖3C)。

脂質(zhì)納米顆粒由于其尺寸小并且具有親脂性而容易被大腦吸收, 這同時(shí)也延長了它們在血液中的循環(huán)時(shí)間并且更容易通過BBB運(yùn)輸。然而當(dāng)靜脈注射LNP時(shí), 血流中吸附在納米顆粒表面的血清蛋白冠通過ApoE受體介導(dǎo)的攝取會將其靶向肝臟。針對這一問題, 研究人員通過對LNP進(jìn)行修飾及設(shè)計(jì)相關(guān)的脂類納米顆粒系統(tǒng), 來改善其對BBB的遞送。例如Su等制備了DPMT@PEI/miR-195納米脂質(zhì)體, 通過P-氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷(P-aminophenyl-alpha-D-mannopyranoside, MAN)和陽離子細(xì)胞穿透肽(cell penetrating peptide, TAT)雙重修飾進(jìn)行工程改造, 該脂質(zhì)體表現(xiàn)出增強(qiáng)的BBB和細(xì)胞膜穿透能力。在APP/PS1小鼠模型中, 與多奈哌齊和阿杜那單抗相比, 通過尾靜脈注射給藥的DPMT@PEI/miR-195顯示出更好的治療效果, 能有效改善認(rèn)知功能, 并減輕Aβ、tau蛋白過度磷酸化和小膠質(zhì)細(xì)胞極化。

目前研究人員發(fā)現(xiàn)通過局部或鼻內(nèi)給藥的LNP能成功轉(zhuǎn)染特定的細(xì)胞類型, 例如大腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞, 神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞等。Cohen等研究發(fā)現(xiàn), 通過顱內(nèi)注射(intracerebral injection, IC)透明質(zhì)酸功能化的LNP能成功幫助將siRNA遞送至小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤。Palanki等使用可電離脂質(zhì)納米顆粒作為遞送平臺, 通過腦室內(nèi)注射, 篩選出一種在圍產(chǎn)期大腦中具有比FDA批準(zhǔn)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LNP更強(qiáng)的功能性mRNA遞送能力的LNP配方(C3LNP), 并通過進(jìn)一步的優(yōu)化使其能夠改善新生小鼠大腦中溶酶體貯積病的生化表型。Ralvenius等優(yōu)化改進(jìn)了一種新型脂質(zhì)納米顆粒—先導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞LNP, 腹腔注射和局部腦室內(nèi)注射的方式都使其能夠安全、高效靶向小膠質(zhì)細(xì)胞, LNP介導(dǎo)的靶向PU.1轉(zhuǎn)錄因子(已知的AD風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn))的siRNA遞送成功地降低了人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的小膠質(zhì)樣細(xì)胞(induced microglia-like cells, iMGL)中的PU.1水平, 并減少了注射LPS的小鼠和CK-p25小鼠的神經(jīng)炎癥。但是像腦室內(nèi)注射這些局部給藥的方式往往是具有侵入性的, 因此現(xiàn)在一些研究也采用與非侵入性方法結(jié)合, 實(shí)現(xiàn)藥物成功穿越血腦屏障, 治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病。Zhao等設(shè)計(jì)一種新型復(fù)合物MB-shBirc5-lipo-NGR, 結(jié)合FUS, 可誘導(dǎo)非侵入性、可逆、局部BBB通透性, 通過實(shí)驗(yàn)證明了FUS輔助的MB-shBirc5-lipo-NGR可以打開BBB并抑制膠質(zhì)瘤生長。

LNP具有親水和疏水區(qū)域, 并且表面電荷可調(diào), 使其能夠封裝各種理化性質(zhì)不同的藥物。這種多功能性允許在同一個(gè)納米顆粒中共同封裝不同類型的藥物。在設(shè)計(jì)LNP時(shí), 研究者不斷優(yōu)化脂質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu), 以提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和靶向性。例如, 通過改變脂質(zhì)尾部的飽和度和連接子的化學(xué)結(jié)構(gòu), 可以調(diào)節(jié)LNP的流動(dòng)性和內(nèi)體逃逸能力。此外, 研究人員也在探索如何通過LNP表面修飾來提高其靶向特定細(xì)胞或組織的能力, 以及如何通過控制LNP的粒徑和表面電荷來優(yōu)化其在體內(nèi)的生物分布和清除率。相比于病毒載體, 使用LNP遞送核酸藥物時(shí)可以有效規(guī)避感染、致癌及免疫原性等風(fēng)險(xiǎn), 能有效保護(hù)核酸藥物免受降解。同時(shí)通過添加輔料, LNP可以協(xié)助免疫激活和潛在的免疫應(yīng)答, 進(jìn)一步增強(qiáng)免疫效果。鑒于LNP在安全性和有效性方面的優(yōu)勢, 它們已成為藥物遞送和疫苗設(shè)計(jì)中的首選載體之一。并且LNP的安全性和有效性已得到了監(jiān)管機(jī)構(gòu)的廣泛認(rèn)可, 目前已成為FDA批準(zhǔn)最多的藥物載體類別。

盡管有這些優(yōu)勢, LNP仍面臨一些挑戰(zhàn), 如容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)快速吸收, 導(dǎo)致其在肝臟和脾臟中積累, 這不僅減少了核酸藥物的可用性, 還增加了這些器官的負(fù)擔(dān)。此外, LNP從內(nèi)體和溶酶體中逃逸的能力有限, 嚴(yán)重影響了核酸藥物的轉(zhuǎn)染效率, 這也是當(dāng)前LNP開發(fā)的關(guān)鍵關(guān)注點(diǎn)。

4.4 聚合物納米載體

聚合物納米顆粒(polymeric nanoparticles, PNPs)是一種尺寸在1~1000nm的納米材料。通常有納米膠囊和納米球兩種形態(tài)結(jié)構(gòu), 納米膠囊是一種囊狀結(jié)構(gòu), 具有被聚合物膜或殼包裹的空腔, 可以控制其中的藥物釋放; 與納米膠囊不同, 納米球是一種固體顆粒系統(tǒng), 藥物或被包裹在構(gòu)成納米球的聚合物基質(zhì)中, 或被吸附在顆粒表面(圖3D)。納米球的設(shè)計(jì)可以使藥物從基質(zhì)或表面逐漸釋放出來, 從而實(shí)現(xiàn)藥物的持續(xù)釋放。在遞送核酸藥物的應(yīng)用中, 聚合物納米顆粒發(fā)揮了重要作用。它們通常是聚合物和核酸藥物通常通過靜電、疏水或氫鍵相互作用而形成的納米顆粒?？梢员环譃槎嗑畚铩⒕酆象w和樹枝狀大分子等幾個(gè)亞類。

多聚物包含陽離子聚合物, 通過靜電相互作用與核酸結(jié)合并凝聚成小而緊密的結(jié)構(gòu), 該凝聚過程是由熵驅(qū)動(dòng)的, 當(dāng)陽離子聚合物與核酸混合時(shí), 多聚物自發(fā)產(chǎn)生。此方法可以產(chǎn)生表面帶正電荷的顆粒, 并更好地將核酸凝聚成更小尺寸的納米顆粒。該策略可以提高核酸藥物的穩(wěn)定性和細(xì)胞攝取效率。其中PEI具有高密度的正電荷, 能夠?qū)崿F(xiàn)高效的核酸藥物裝載及通過質(zhì)子海綿效應(yīng)逃逸內(nèi)體/溶酶體。Rytblat等通過PEI的靜電吸附增強(qiáng)了抗miR-125b ASO在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的攝取和內(nèi)體逃逸。MiR-125b在GBM細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào), 并通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡, 在GBM細(xì)胞中發(fā)揮致癌效應(yīng)。Sheikh等的研究顯示, 聚賴氨酸修飾的PEI(PLys-PEI)和PEI相比, 明顯提高了核酸藥物的轉(zhuǎn)染效率, 同時(shí)降低了PNPs的毒性。通過將PLys-PEI與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) pDNA相結(jié)合, 借助立體定位引導(dǎo)實(shí)施腦內(nèi)注射, 發(fā)現(xiàn)負(fù)載有VEGF pDNA的PNP能夠在神經(jīng)元中實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染, 顯示出其在PD基因治療領(lǐng)域的潛力。

聚合體是由兩親性嵌合共聚物制成的聚合物囊泡, 通過疏水效應(yīng)自組裝形成具有親水核心和疏水涂層的納米球, 具有親水性的各種核酸(例如pDNA, ASO和siRNA)可以被有效地封裝到聚合物囊泡內(nèi)部的水核中。例如Pangburn等發(fā)現(xiàn)由聚(1, 2-丁二烯)-b-聚(環(huán)氧乙烷)嵌段共聚物自組裝形成的聚合體, 可以用作siRNA的遞送系統(tǒng), 包封率約為51%。

樹枝狀大分子是由通過迭代的反應(yīng)步驟, 在每次生長中增加分支, 形成具有樹枝狀結(jié)構(gòu)的聚合物, 包含內(nèi)核、重復(fù)單元和表面功能化3個(gè)部分。隨著支化程度的增加, 最終形成封閉的三維球體, 內(nèi)藏空腔結(jié)構(gòu), 表面可以通過將不同分子與反應(yīng)性末端基團(tuán)偶聯(lián)來實(shí)現(xiàn)功能化。最常見的樹枝狀大分子有聚酰胺-胺(polyamidoamine, PAMAM)、聚賴氨酸[poly(L-lysine), PLL]、聚丙烯亞胺[poly(propylene imine), PPI]等。Kim等使用可生物降解的PAMAM樹枝狀聚合物e-PAM-R包載編碼高遷移率蛋白(high mobility group box protein1, HMGB1)的siRNA, 發(fā)現(xiàn)經(jīng)鼻遞送的HMGB1siRNA能通過下調(diào)HMGB1表達(dá), 抑制缺血后大鼠腦梗死體積, 并有助于神經(jīng)和行為缺陷的恢復(fù)。Cai等設(shè)計(jì)了一種基于樹突狀結(jié)構(gòu)DGL的siRNA和D肽(D peptide, Dp)負(fù)載的納米顆粒, 能夠靶向并穿透BBB, 進(jìn)入腦實(shí)質(zhì), 并在AD病變處積累。通過特異性靶向BBB上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的T7肽和可酸裂解的長聚乙二醇, 實(shí)現(xiàn)高內(nèi)化和有效的轉(zhuǎn)胞吞作用。專門針對患病神經(jīng)元的Tet1通過短PEG修飾為DGL, 驅(qū)動(dòng)納米顆粒到AD病灶并釋放藥物, 最終抑制了Aβ的產(chǎn)生, 緩解了Aβ斑塊和tau蛋白磷酸化(p-tau)纏結(jié)誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性, 顯著提高了AD小鼠的認(rèn)知能力。

目前研究發(fā)現(xiàn)通過血腦屏障效率高度依賴于PNPs的物理化學(xué)特性。聚合物納米顆粒提供了一種可調(diào)控的藥物釋放和降解特性, 通過改變其大小和表面電荷, 或者通過使用特定的修飾和靶向基團(tuán)可以改善PNPs的血液循環(huán)時(shí)間、生物分布和穿透BBB的能力, 進(jìn)一步增強(qiáng)其遞送效率和細(xì)胞攝取率。

4.5 外泌體

近年來, 外泌體在核酸藥物遞送領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注, 其獨(dú)特的內(nèi)源性生物學(xué)特性為多種治療性核酸(如siRNA、miRNA、mRNA和ASO等)的精準(zhǔn)、高效運(yùn)輸提供了新的策略。外泌體是一種異質(zhì)性的內(nèi)源細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs), 幾乎可以由所有的細(xì)胞產(chǎn)生, 直徑約為30~150nm, 具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu), 膜上附著有黏附分子間質(zhì), 主要組織相容性復(fù)合體和多種蛋白質(zhì)(四跨膜蛋、熱休克蛋白、免疫調(diào)節(jié)蛋白等), 內(nèi)腔含有多種多肽、核酸、氨基酸和代謝物等(圖3E)。作為細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵參與者, 外泌體既可通過表面配體直接接觸并激活受體細(xì)胞, 也可通過內(nèi)吞作用將核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在內(nèi)的多種生物活性分子從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞, 發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。

外泌體具有良好的生物相容性和較低的免疫原性, 能夠在細(xì)胞間傳遞核酸、蛋白等信號分子。在跨越BBB和實(shí)現(xiàn)腦靶向遞送方面, 外泌體展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢, 其表面配體與大腦內(nèi)皮細(xì)胞受體之間的相互作用被認(rèn)為是外泌體腦靶向的主要機(jī)制。研究表明, 源自內(nèi)皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的外泌體能夠攜帶小分子藥物和siRNA穿過血腦屏障。在小鼠卒中模型中, 與間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的EV相比, 神經(jīng)干細(xì)胞衍生的EV顯示出優(yōu)先的大腦靶向。然而, 外泌體在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn), 其生產(chǎn)和純化過程復(fù)雜、產(chǎn)量低且穩(wěn)定性差, 限制了大規(guī)模的生產(chǎn)和應(yīng)用; 體內(nèi)靶向性不夠明確, 遞送效率仍然有限, 影響了其治療效果的發(fā)揮。

為了增強(qiáng)外泌體遞送能力并克服其固有局限, 研究人員基于仿生理念, 將多種工程技術(shù)與外泌體的天然生物學(xué)特性融合, 開發(fā)工程化外泌體。通過基因工程和納米工程技術(shù)等實(shí)現(xiàn)外泌體規(guī)?；a(chǎn)和高效純化, 并引入促穩(wěn)定成分和特殊包覆技術(shù)增強(qiáng)其穩(wěn)定性, 防止內(nèi)部大分子荷載的降解或失活。同時(shí), 表面修飾特定配體, 提高靶向性, 確保藥物或基因精準(zhǔn)遞送至目標(biāo)細(xì)胞, 提升治療效果并減少不良反應(yīng)。例如Alvarez-Erviti等發(fā)現(xiàn)通過靜脈注射經(jīng)過神經(jīng)元特異性RVG肽修飾低免疫刺激性的樹突狀細(xì)胞來源的外泌體, 成功將GAPDH siRNA特異性地遞送至大腦中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞, 實(shí)現(xiàn)了特異性基因敲低, 且重復(fù)注射不影響效果; RVG外泌體遞送BACE1 siRNA可顯著降低阿爾茨海默病治療靶點(diǎn)BACE1的mRNA和蛋白水平, 減少Aβ1-42水平, 且未引起明顯免疫反應(yīng)。

相關(guān)的外泌體遞送系統(tǒng)主要通過內(nèi)源性和外源性兩種載藥方式載帶核酸藥物(圖3F)。其中內(nèi)源性加載是指通過基因工程、代謝標(biāo)記和外源導(dǎo)入等策略對親本細(xì)胞進(jìn)行特異性修飾, 從而使得這些細(xì)胞分泌的外泌體攜載需要遞送的藥物。常用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的內(nèi)源性方式將核酸藥物加載到外泌體中, 其優(yōu)點(diǎn)是保留了外泌體的生物功能及其完整性, 但它同時(shí)需要復(fù)雜的操作步驟, 實(shí)驗(yàn)周期較長, 制備成本較高。外源性加載則是在分離和收集外泌體后采用共孵育、電穿孔、超聲處理、反復(fù)凍融、共擠出等技術(shù), 在外泌體表面或者內(nèi)腔修飾和裝載所需藥物或者靶向試劑, 相對來說更具有靈活性, 并且可以通過針對特定靶標(biāo)的定向性修飾來提高靶向性。然而, 外源性藥物裝載也可能會面臨外泌體的完整性被破壞, 有未被捕獲的藥物需要額外的步驟來除去等問題。

將治療性外泌體遞送到靶細(xì)胞有被動(dòng)靶向和主動(dòng)靶向兩種方式, 其中的被動(dòng)靶向是指不同類型的天然外泌體可以黏附不同的細(xì)胞, 具有來源于供體細(xì)胞的天然靶向能力。而主動(dòng)靶向則利用各種技術(shù)方法通過外泌體表面工程實(shí)現(xiàn)外泌體的靶向遞送。

外泌體在腦部核酸藥物遞送方面具有極大的潛力, 雖然目前像脂質(zhì)體、聚合物納米顆粒等制劑都可以利用其納米尺寸跨越血腦屏障來實(shí)現(xiàn)核酸藥物的腦靶向遞送, 但會存在血液毒性和機(jī)體內(nèi)蓄積的問題; 而本身就具有穿透血腦屏障的內(nèi)源性外泌體具有更低的毒性和免疫原性, 生物相容度高, 血液循環(huán)穩(wěn)定性和組織選擇性好, 并且可以對其進(jìn)行復(fù)雜的工程化改造, 是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ哪X部核酸藥物遞送體系。

 

5展望與挑戰(zhàn)

核酸藥物, 包括siRNA、miRNA、ASOs、mRNA、pDNA和CRISPR/Cas系統(tǒng), 以其在基因水平上的精準(zhǔn)調(diào)控, 革新了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療思路, 也為更多健康問題的解決提供了新的機(jī)會。它們能夠精確調(diào)控基因表達(dá), 為神經(jīng)退行性疾病、腦部腫瘤和腦血管疾病等復(fù)雜疾病提供了新的治療方法。隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步, 核酸藥物已經(jīng)成為21世紀(jì)生物技術(shù)革命的前沿, 它們不僅補(bǔ)充了傳統(tǒng)藥物, 還代表著生物治療方式從“被動(dòng)控制”向“主動(dòng)干預(yù)”的范式轉(zhuǎn)移: 通過精準(zhǔn)調(diào)控基因表達(dá), 直接干預(yù)疾病的發(fā)生和發(fā)展, 從根本上改變疾病的進(jìn)程。核酸藥物的成功應(yīng)用有望從分子和細(xì)胞層面重塑疾病的病理機(jī)制, 為遺傳性和后天性腦部疾病的治療帶來進(jìn)一步突破。

然而, 要實(shí)現(xiàn)核酸藥物的有效應(yīng)用, 必須克服BBB這一生理障礙。盡管BBB作為大腦的生理防護(hù)系統(tǒng)能有效阻擋有害物質(zhì)入侵, 但同時(shí)也限制了治療性大分子藥物的進(jìn)入。為突破這一瓶頸, 科研人員開發(fā)了多種創(chuàng)新策略, 包括利用超聲波和電穿孔等物理方法暫時(shí)性地增加BBB的通透性, 以及開發(fā)病毒載體、LNP、聚合物納米顆粒和生物源性外泌體等多樣化遞送系統(tǒng)。這些遞送系統(tǒng)各具特色, 展現(xiàn)了不同的優(yōu)勢, 也面臨著各自的挑戰(zhàn): 病毒載體可能引發(fā)安全隱患, LNP可能誘發(fā)免疫反應(yīng), 而外泌體則存在規(guī)?；a(chǎn)困難等問題。為了解決這些問題, 研究者不僅致力于優(yōu)化現(xiàn)有遞送系統(tǒng)的效率, 還不斷創(chuàng)新, 通過生物工程手段對遞送載體進(jìn)行表面修飾和功能化設(shè)計(jì), 以增強(qiáng)其在穿越BBB時(shí)的靶向性和生物相容性。例如, 表面修飾靶向分子或肽類, 可以幫助遞送系統(tǒng)更有效地穿越BBB, 并將核酸藥物遞送到特定的腦區(qū)或細(xì)胞。同時(shí), 還在開發(fā)多功能納米載體, 這些載體集成了靶向、響應(yīng)性釋放和成像功能, 能夠?qū)崿F(xiàn)更精準(zhǔn)的遞送和實(shí)時(shí)監(jiān)控。

這些技術(shù)的進(jìn)步不僅為核酸藥物的遞送開辟了新途徑, 也在重塑藥物遞送的未來, 推動(dòng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療向精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)邁進(jìn)。核酸藥物的應(yīng)用標(biāo)志著藥物開發(fā)領(lǐng)域的革命性突破, 并體現(xiàn)了醫(yī)學(xué)科學(xué)向跨學(xué)科融合和個(gè)性化治療策略的重要轉(zhuǎn)型。隨著遞送技術(shù)的不斷優(yōu)化和創(chuàng)新, 核酸藥物有望在更廣泛的醫(yī)療領(lǐng)域發(fā)揮作用, 推動(dòng)疾病治療范式從“控制癥狀”向“精準(zhǔn)治愈”轉(zhuǎn)變, 為人類健康開辟新的前沿。