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摘要

單克隆抗體類藥物因其高特異性和廣泛的臨床應(yīng)用前景，已成為生物制品領(lǐng)域的重要組成部分，而產(chǎn)品異質(zhì)性一直以來(lái)都是業(yè)界以及監(jiān)管機(jī)構(gòu)重點(diǎn)關(guān)注的問題之一，隨著單克隆抗體類藥物數(shù)量的不斷增加以及經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，業(yè)界以及監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)于部分異質(zhì)性問題已經(jīng)達(dá)成基本共識(shí)，但對(duì)于序列變異體的研究及經(jīng)驗(yàn)相對(duì)有限，仍是監(jiān)管和研發(fā)關(guān)注的重點(diǎn)。本文結(jié)合審評(píng)實(shí)踐，從序列變異體的概念以及產(chǎn)生原因等方面，探討了以氨基酸替換為代表的序列變異體的審評(píng)考慮，以期為該類藥物的研發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：單克隆抗體；序列變異體；單克隆性

近年來(lái)，生物制品行業(yè)快速發(fā)展，單克隆抗體憑借其高特異性的特點(diǎn)已成為治療性重組生物制品中的一個(gè)重要組成部分，被廣泛應(yīng)用于腫瘤、自身免疫疾病及其他多種疾病的治療，并且其應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大。隨著產(chǎn)品數(shù)量的增多以及經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，對(duì)于單克隆抗體類藥物的認(rèn)知已逐漸趨于成熟。在該類藥物的研發(fā)及上市申報(bào)中，異質(zhì)性一直以來(lái)都是企業(yè)研發(fā)人員以及監(jiān)管機(jī)構(gòu)重點(diǎn)關(guān)注的問題，包括分子大小異構(gòu)體、電荷異構(gòu)體、糖基化修飾異構(gòu)體以及序列變異體等。雖然針對(duì)一些異質(zhì)性問題已達(dá)成基本共識(shí)，認(rèn)為可以通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、工藝控制以及質(zhì)量控制等將其在可控范圍內(nèi)進(jìn)行管理，但對(duì)于以非預(yù)期序列變異體為代表的序列異質(zhì)性的研究較為有限，業(yè)界以及監(jiān)管機(jī)構(gòu)在其研究及控制等方面仍未達(dá)成共識(shí)，需要深入探討。本文將從序列變異體及產(chǎn)生原因、審評(píng)考慮以及挑戰(zhàn)與展望三方面對(duì)單克隆抗體類藥物中序列變異體進(jìn)行闡述，以期為藥物的研發(fā)和監(jiān)管提供參考，并促進(jìn)業(yè)界對(duì)這一問題的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)與討論。

1 序列變異體及產(chǎn)生原因

序列變異體是指不同于目標(biāo)序列的變異體，分為可預(yù)期的序列變異體及非預(yù)期的序列變異體?？深A(yù)期的序列變異體包括N端的谷氨酸/谷氨酰胺環(huán)化、信號(hào)肽序列變化和C端Lys/Gly?Lys的缺失以及缺失后Pro的酰胺化等。N端的谷氨酸/谷氨酰胺環(huán)化可以由酶促反應(yīng)，也可以由非酶促反應(yīng)產(chǎn)生，可以發(fā)生在發(fā)酵、純化、藥品灌裝、儲(chǔ)存以及分析等過(guò)程中。信號(hào)肽序列變化可能由于mRNA的錯(cuò)誤剪接以及信號(hào)肽酶的切割位點(diǎn)錯(cuò)誤，導(dǎo)致N端的伸長(zhǎng)或截短。C末端的賴氨酸殘基容易被內(nèi)源性羧肽酶去除，從而導(dǎo)致C端的異質(zhì)性。通過(guò)全面的研究以及采用合適的控制策略，如對(duì)終產(chǎn)品中各變異體的鑒定、成因分析、含量測(cè)定、生物學(xué)活性分析、雜質(zhì)去除研究以及根據(jù)非臨床/臨床試驗(yàn)結(jié)果對(duì)產(chǎn)品的安全性、有效性的影響進(jìn)行分析等，來(lái)達(dá)到對(duì)該類變異體有效控制的目的，這在業(yè)界以及監(jiān)管方已基本達(dá)成共識(shí)。

可預(yù)期的序列變異體之外的均可視為非預(yù)期的序列變異體，在成品中表現(xiàn)為氨基酸片段的增加、缺失以及氨基酸替換等，產(chǎn)生原因涉及核苷酸以及氨基酸層面。在核苷酸層面，基因突變可能通過(guò)重排或移碼突變等機(jī)制影響氨基酸序列，而同義突變等則可能不影響氨基酸序列。重要的是，核苷酸突變一旦發(fā)生就會(huì)成為固定的遺傳特征并會(huì)在細(xì)胞中穩(wěn)定地表達(dá)。相比之下，轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤（如外顯子跳躍等）、翻譯錯(cuò)誤以及培養(yǎng)環(huán)境的變化等因素導(dǎo)致的氨基酸序列變異則是隨機(jī)的，它們不會(huì)長(zhǎng)期固定并持續(xù)表達(dá)。盡管序列的增加/缺失等對(duì)產(chǎn)品的影響極大，但由于該類變異體在分子量以及肽圖等方面會(huì)存在明顯異常，因此往往在產(chǎn)品開發(fā)初期，如單克隆篩選過(guò)程中就會(huì)被淘汰。而對(duì)于序列中氨基酸替換產(chǎn)生的序列變異體，盡管在單克隆抗體的開發(fā)過(guò)程中，研發(fā)人員通常會(huì)進(jìn)行嚴(yán)格的篩選和控制，但因其與目標(biāo)序列存在更小的質(zhì)量差異且含量一般較低，更容易出現(xiàn)在終產(chǎn)品中，影響產(chǎn)品的安全性和有效性。目前對(duì)于此類非預(yù)期氨基酸替換序列變異體的經(jīng)驗(yàn)較為有限，這也是研發(fā)人員以及監(jiān)管更關(guān)注的問題，也是本文討論的重點(diǎn)。

非預(yù)期氨基酸替換序列變異體產(chǎn)生的原因同樣是多方面的。盡管生物體內(nèi)DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及翻譯中存在高保真性，但仍然存在一定概率的變異性，如單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）導(dǎo)致的DNA錯(cuò)義突變、堿基替換等導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤、tRNA的錯(cuò)酰化以及密碼子?反密碼子中的第3位擺動(dòng)錯(cuò)配導(dǎo)致的氨基酸錯(cuò)配/誤譯等，這也意味著在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，極低水平的序列變異體是不可避免的，也被稱為生物噪聲。在商業(yè)化生產(chǎn)中，研發(fā)者為了達(dá)到更高的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，往往通過(guò)提高發(fā)酵密度、延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間等方式來(lái)達(dá)到高產(chǎn)目的，這也使得工程細(xì)胞處于一個(gè)更大的壓力條件下，進(jìn)一步增加其轉(zhuǎn)錄、翻譯的錯(cuò)配概率，因此商業(yè)化條件下的生物噪聲會(huì)顯著高于天然條件下。在發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)胞的應(yīng)激、快速生長(zhǎng)、誘變劑及活性氧的存在以及培養(yǎng)基中的某些氨基酸耗盡也會(huì)導(dǎo)致翻譯過(guò)程的錯(cuò)配概率增高，有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)充分優(yōu)化的發(fā)酵系統(tǒng)的生物噪聲比天然條件下的生物噪聲會(huì)增加10倍，未經(jīng)充分優(yōu)化的發(fā)酵系統(tǒng)的生物噪聲則會(huì)更高。在單克隆篩選過(guò)程中以及細(xì)胞庫(kù)建立過(guò)程中所產(chǎn)生的非單克隆也是產(chǎn)生序列變異體的主要原因之一，并且這類變異體在終產(chǎn)品中的含量往往較高，風(fēng)險(xiǎn)也較大，也是需要重點(diǎn)關(guān)注的類型。

2 氨基酸替換序列變異體的審評(píng)考慮

2.1 氨基酸替換序列變異體的風(fēng)險(xiǎn)

非預(yù)期氨基酸替換序列變異體可以定義為一類特殊的非預(yù)期雜質(zhì)或有關(guān)物質(zhì)。因氨基酸替換所在位置不同以及替換前后氨基酸性質(zhì)的差異，可能對(duì)產(chǎn)品的空間結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生物學(xué)活性、免疫原性、藥動(dòng)學(xué)甚至安全性產(chǎn)生影響。例如：若突變發(fā)生在關(guān)鍵的折疊位點(diǎn)，可能影響產(chǎn)品的正確折疊，導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響產(chǎn)品活性并可能導(dǎo)致新的免疫表位的形成，使得產(chǎn)品的免疫原性增加，導(dǎo)致患者產(chǎn)生抗藥物抗體，影響藥物的安全性和有效性。若替換發(fā)生在互補(bǔ)決定區(qū)，則可能影響產(chǎn)品與配體/底物的結(jié)合，進(jìn)而對(duì)產(chǎn)品的結(jié)合活性以及生物學(xué)活性產(chǎn)生影響。替換前后氨基酸性質(zhì)的變化以及糖基化連接氨基酸（Asn，Ser，Thr）的替換，可能影響產(chǎn)品的糖基化水平、體內(nèi)的半衰期等，從而影響其藥動(dòng)學(xué)特性，這可能導(dǎo)致治療劑量的變化，影響療效。

2.2 氨基酸替換序列變異體研究面臨的困難

單克隆抗體類藥物中的非預(yù)期氨基酸替換序列變異體由于替換位點(diǎn)以及替換氨基酸種類的不確定性，導(dǎo)致可能產(chǎn)生極其復(fù)雜多樣的序列變體，同時(shí)在同一個(gè)產(chǎn)品中產(chǎn)生替換的位點(diǎn)可能存在多個(gè)，使變異體種類更加多樣，這也使得研究難度進(jìn)一步增大，因此需要具體問題具體分析。另一方面，氨基酸替換序列變異體的含量往往處于較低水平，對(duì)其檢出及準(zhǔn)確定量都需要具有高靈敏度的分析方法，因此對(duì)分析方法的靈敏度及方法學(xué)驗(yàn)證提出了更高的要求。而目前對(duì)氨基酸替換序列變異體進(jìn)行分析所產(chǎn)生的成本往往較高、耗時(shí)較長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)于該類雜質(zhì)的研究及控制經(jīng)驗(yàn)較為有限，這也成為氨基酸替換序列變異體的研究及控制方面的一大挑戰(zhàn)。

2.3 分析方法

由于氨基酸替換序列變異體與目標(biāo)產(chǎn)品的分子量差異較小，并且含量較低，對(duì)分析方法的靈敏度有著較高的要求。氨基酸替換序列變異體可能由核苷酸突變引起并在蛋白質(zhì)層面表現(xiàn)，因此目前氨基酸替換序列變異體常用的分析方法涉及核酸與蛋白質(zhì)2個(gè)層面。

2.4 氨基酸替換序列變異體的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及控制策略

2.4.1 鑒定及分析

氨基酸替換序列變異體的鑒定是后續(xù)開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及制定合理控制策略的基礎(chǔ)。應(yīng)采用合適的分析方法明確突變發(fā)生的個(gè)數(shù)、位點(diǎn)、突變前后的氨基酸種類等信息，同時(shí)分析方法的可靠性對(duì)鑒定結(jié)果存在重要影響，應(yīng)予以關(guān)注。

氨基酸替換序列變異體的形成階段及原因同樣是非常重要的信息，可以通過(guò)合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)明確該變異發(fā)生的階段及原因，如通過(guò)對(duì)原始細(xì)胞庫(kù)、主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)或生產(chǎn)終末細(xì)胞（end of production cell，EOPC）進(jìn)行基因測(cè)序，以確認(rèn)在細(xì)胞庫(kù)中是否存在該序列變異體以及突變是否發(fā)生在發(fā)酵過(guò)程中。尤其應(yīng)關(guān)注細(xì)胞庫(kù)的單克隆性驗(yàn)證，若工程細(xì)胞或細(xì)胞庫(kù)中已存在發(fā)生基因變異的菌株，則會(huì)導(dǎo)致序列變異體在終產(chǎn)品中的存在。同時(shí)通過(guò)充分的工藝表征以確定影響其含量的所有因素，考慮細(xì)胞庫(kù)傳代代次、生產(chǎn)規(guī)模、生產(chǎn)條件（如接種密度、培養(yǎng)溫度、pH值、培養(yǎng)基和補(bǔ)料濃度等）以及培養(yǎng)基組成等與該變異體的產(chǎn)生及含量變化的相關(guān)性。

2.4.2 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及控制策略

氨基酸替換序列變異體的風(fēng)險(xiǎn)大小需要根據(jù)多方面的研究結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)估，如序列變異體的鑒定結(jié)果、形成階段及原因、序列變異體對(duì)產(chǎn)品理化性質(zhì)（如聚集行為、等電點(diǎn)等）、高級(jí)結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性以及體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響、影響序列變異體水平的因素、是否可以通過(guò)工藝控制來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)該變異體含量的穩(wěn)定控制、該變異體對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響、支持該序列變異體安全性的數(shù)據(jù)、產(chǎn)品的適應(yīng)證以及產(chǎn)品作用機(jī)制、目標(biāo)患者的免疫環(huán)境以及患者的個(gè)體差異等，影響風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果的因素較多，因此需要具體問題具體分析。同時(shí)考慮在產(chǎn)品生命周期管理中，序列變異體的出現(xiàn)可能導(dǎo)致產(chǎn)品上市后變更事項(xiàng)（如細(xì)胞庫(kù)制備以及貯存的工藝條件變更、培養(yǎng)基組成變更等）風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)的提高。

控制策略方面，根據(jù)“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）”的理念，在產(chǎn)品設(shè)計(jì)階段，就應(yīng)盡可能避免或降低氨基酸替換序列變異體出現(xiàn)的概率，如選擇高保真度的菌株或表達(dá)系統(tǒng)；在目的基因人源化過(guò)程中，考慮進(jìn)行充分的密碼子優(yōu)化，采用高頻率使用的密碼子替代稀有密碼子[9]；在工程細(xì)胞系建立及篩選階段，設(shè)計(jì)合適的方法進(jìn)行工程細(xì)胞系單克隆篩選，如有限稀釋法、熒光激活細(xì)胞分選（fluo?rescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS）、高通量細(xì)胞克隆篩選系統(tǒng)（如ClonePix和CellCelecter）等方法配合拍照技術(shù)[8]，同時(shí)應(yīng)考慮篩選指標(biāo)的合理性，采用多方面的綜合指標(biāo)進(jìn)行篩選，而非單純考慮生產(chǎn)能力或活率；在發(fā)酵階段，保證所需的氨基酸充足[10]，減少氧自由基的出現(xiàn)；在純化階段，必要時(shí)根據(jù)產(chǎn)品與變體間的物理和化學(xué)性質(zhì)差異進(jìn)行分離純化等。

在產(chǎn)品開發(fā)初期，針對(duì)關(guān)鍵環(huán)節(jié)（如細(xì)胞單克隆性、培養(yǎng)基組成）開展全面的篩選及驗(yàn)證研究，避免氨基酸替換序列變異體在終產(chǎn)品中出現(xiàn)。氨基酸替換序列變異體可能發(fā)生在工程細(xì)胞篩選過(guò)程中，造成工程細(xì)胞的單克隆性問題，也可能產(chǎn)生在發(fā)酵階段。因此可以采用多種方法[如熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、Southern印跡雜交（southern blot）、NGS等]對(duì)細(xì)胞庫(kù)的單克隆性進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)基因序列以及氨基酸序列進(jìn)行確證；對(duì)培養(yǎng)基開展充分的篩選工作，選擇合適的培養(yǎng)基或通過(guò)補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方式，確保所需氨基酸組分的充足；對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行充分表征，通過(guò)工藝參數(shù)控制或補(bǔ)加還原劑等方式實(shí)現(xiàn)對(duì)活性氧水平的全程控制等[9]。

對(duì)于產(chǎn)品開發(fā)后期才發(fā)現(xiàn)氨基酸替換序列變異體的產(chǎn)品，需要開展全面的鑒定及分析研究，綜合評(píng)估序列變異體所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)開展全面的表征研究，對(duì)影響該序列變異體含量及穩(wěn)定性的因素進(jìn)行充分分析?？梢葬槍?duì)變體與產(chǎn)品性質(zhì)差異，開發(fā)適合的純化方法進(jìn)行變異體的進(jìn)一步去除。通過(guò)富集操作或重新構(gòu)建突變后的基因序列，并經(jīng)發(fā)酵純化制備獲得含較高水平序列變體的產(chǎn)品或高純度序列變體。若經(jīng)評(píng)估及表征研究發(fā)現(xiàn)無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效控制，產(chǎn)生安全性風(fēng)險(xiǎn)、影響產(chǎn)品有效性或質(zhì)量均一性，可能需要考慮重新進(jìn)行工程細(xì)胞系的建立以及篩選。同時(shí)關(guān)注由于序列變異體存在導(dǎo)致的后續(xù)變更事項(xiàng)風(fēng)險(xiǎn)提高的問題。

對(duì)于氨基酸替換序列變異體可接受標(biāo)準(zhǔn)的擬定，需要綜合考慮非臨床研究以及臨床研究中所使用樣品的變體水平。若研究發(fā)現(xiàn)序列變異體水平受工藝參數(shù)影響，則該工藝參數(shù)的重要等級(jí)應(yīng)相應(yīng)提高。若經(jīng)驗(yàn)證證明序列變異體水平與傳代代次有關(guān)，則應(yīng)嚴(yán)格控制限傳代次。若與培養(yǎng)基成分相關(guān)，則培養(yǎng)基成分及其來(lái)源的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)也應(yīng)相應(yīng)提高。對(duì)于序列變異體控制策略的擬定，如控制水平以及控制階段等問題，建議與監(jiān)管機(jī)構(gòu)積極溝通。

3 挑戰(zhàn)與展望

單克隆抗體類藥物中的非預(yù)期氨基酸替換序列變異體由于其變異位點(diǎn)以及變異種類的多樣性，可以產(chǎn)生復(fù)雜多樣的序列變體。而該類變異體與目標(biāo)產(chǎn)品存在較小的質(zhì)量差異且含量一般較低，也更容易出現(xiàn)在終產(chǎn)品中，同時(shí)由于生物噪聲的存在，伴隨發(fā)酵壓力對(duì)生物噪聲的進(jìn)一步放大以及目前分析方法的局限性，對(duì)非預(yù)期氨基酸替換序列變異體的發(fā)現(xiàn)及研究均提出了較大挑戰(zhàn)。根據(jù)其發(fā)生變異的不同原因及不同階段，也需要采用針對(duì)性的控制策略，因此對(duì)于每一個(gè)序列變異體案例均需要具體問題具體分析，這也給研發(fā)人員及監(jiān)管機(jī)構(gòu)提出了更高的要求。

依據(jù)“QbD”的思想，產(chǎn)品設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)盡量規(guī)避序列變異體的出現(xiàn)或降低其出現(xiàn)概率。在產(chǎn)品研發(fā)早期階段進(jìn)行嚴(yán)格篩選，采用合適的分析方法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行鑒定對(duì)于避免非預(yù)期序列變異體進(jìn)入終產(chǎn)品是很有必要的。若在產(chǎn)品研發(fā)后期發(fā)現(xiàn)氨基酸替換序列變異體的存在，則應(yīng)對(duì)該變異體進(jìn)行充分的研究，明確其突變類型，對(duì)其成因及發(fā)生階段進(jìn)行分析，進(jìn)一步結(jié)合非臨床、臨床研究等數(shù)據(jù)綜合評(píng)估對(duì)產(chǎn)品安全性、有效性的影響，通過(guò)工藝表征等方式確定影響其含量及穩(wěn)定性的工藝條件，并進(jìn)行相應(yīng)控制。同時(shí)，序列變異體的出現(xiàn)也可能導(dǎo)致原材料或工藝變更等的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)提高，在實(shí)際工作中應(yīng)予以關(guān)注。本文結(jié)合審評(píng)實(shí)踐，從序列變異體的概念以及產(chǎn)生原因等方面，探討了以氨基酸替換序列變異體為代表的序列異質(zhì)性的審評(píng)考慮，以期為該類藥物的研發(fā)提供參考。