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在過去的幾十年中，基于嵌合抗原受體（CAR）T細胞的細胞療法徹底改變了癌癥的治療方式，尤其是血液系統(tǒng)疾病。CAR-T細胞是經(jīng)過基因工程改造的T淋巴細胞，能夠識別特定抗原，其結(jié)構(gòu)由四個部分組成。第一部分是外部結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域負責與靶抗原結(jié)合，決定了CAR-T的親和力和特異性。它通常由單鏈可變片段（scFv）組成。第二部分是鉸鏈區(qū)，通常由IgG1或IgG4的鉸鏈-CH2-CH3Fc結(jié)構(gòu)域，或CD4、CD8、CD3ζ或CD28的部分組成。鉸鏈區(qū)對于CAR-T細胞激活，并攻擊腫瘤靶細胞至關(guān)重要。它還連接scFv與CAR結(jié)構(gòu)的第三部分——跨膜區(qū)?？缒^(qū)調(diào)節(jié)CAR信號傳導，并控制CAR在T細胞表面的表達。CAR結(jié)構(gòu)的最后一個部分是細胞內(nèi)信號傳導區(qū)，其組成在不同代CAR-T細胞中有所不同，但所有CAR-T細胞中均包含CD3ζ信號傳導區(qū)。

 

CAR技術(shù)的優(yōu)勢在于其對靶抗原的特異性和對腫瘤細胞的強大細胞毒性。隨著CAR-T細胞的發(fā)展，細胞內(nèi)信號傳導區(qū)不斷優(yōu)化，以降低毒性并提高效率。第一代CAR-T細胞結(jié)構(gòu)最簡單，僅包含外部結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及CD3ζ作為細胞內(nèi)信號傳導區(qū)。第二代CAR-T細胞在細胞內(nèi)信號傳導區(qū)增加了共刺激結(jié)構(gòu)域（如CD28或4-1BB），以增強T細胞多次暴露于抗原后的增殖能力。第三代CAR-T細胞同時包含CD28和4-1BB兩種共刺激結(jié)構(gòu)域。第四代CAR-T細胞也稱為“T細胞重定向用于通用細胞因子殺傷（TRUCK）”，其特點是增加了細胞因子（如IL-12）的表達模塊。這些細胞因子由CAR-T細胞釋放，用于調(diào)節(jié)T細胞反應、增強NK細胞的激活，并將巨噬細胞極化為對抗腫瘤細胞的M1表型。除了IL-12，IL-2、IL-7、IL-10、IL-15、IL-18、IL-23和IL-27等細胞因子也在研究中。第五代CAR-T細胞結(jié)構(gòu)中包含截短的細胞質(zhì)IL-2受體β鏈結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠與轉(zhuǎn)錄因子信號轉(zhuǎn)導和激活轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）結(jié)合。當T細胞與抗原結(jié)合時，會同時激活TCR（通過CD3ζ結(jié)構(gòu)域）、共刺激結(jié)構(gòu)域（CD28結(jié)構(gòu)域）以及細胞因子JAK-STAT3/5信號通路。IL-2受體β鏈結(jié)構(gòu)域和JAK-STAT通路可促進細胞增殖，防止細胞終末分化。

 

CAR-T細胞療法在治療B細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）和彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）患者中取得了前所未有的高完全緩解（CR）率。截至目前，F(xiàn)DA已經(jīng)批準了7款基于CAR-T細胞的療法，相關(guān)信息總結(jié)如下表。

 

CAR-T細胞療法的有效性無可爭議，但這種治療方法也有其局限性。只有少數(shù)接受治療的患者實現(xiàn)了CR。同時，許多患者遭受了嚴重的毒性，包括細胞因子釋放綜合征（CRS）、免疫效應細胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS），甚至在某些情況下導致死亡。此外，相當數(shù)量的患者（高達66%）在治療后出現(xiàn)復發(fā)。

 

CAR-T細胞療法的成功與否在很大程度上受到生產(chǎn)過程的影響。每一個步驟都面臨挑戰(zhàn)，并且可以進一步改進。比如自體或異體T細胞的收集，以及它們在輸注前的耗竭狀態(tài)，對CAR-T細胞療法的療效有重大影響。另外，體外過度刺激T細胞會導致其早期耗竭，而轉(zhuǎn)染方法可能導致T淋巴細胞的惡性轉(zhuǎn)化。本文總結(jié)了體外CAR-T細胞的純化、擴增和表征方法。

 

起始物料選擇

自體和異體移植

 

CAR-T細胞制造的初始步驟是選擇和收集起始材料。在自體CAR-T細胞療法中，T細胞是從患者體內(nèi)提取的，并在經(jīng)過實驗室改造后重新輸注回同一位患者體內(nèi)。而在異體移植（通常稱為“現(xiàn)貨型/健康供體”）中，T淋巴細胞來源于健康供體，并被輸注給癌癥患者。這兩種程序各有優(yōu)缺點。

 

自體移植的優(yōu)點是沒有移植物抗宿主病（GvHD）的風險，并且與異體移植相比，細胞在體內(nèi)的持久性更長。然而，自體T細胞療法也面臨諸多挑戰(zhàn)，包括復雜的生產(chǎn)過程、高成本、T細胞的變異性、由于先前腫瘤治療導致的T細胞耗竭和功能障礙等。CAR-T細胞的療效在很大程度上取決于純化T淋巴細胞的特性，而這些特性可能受到患者年齡、癌癥類型、既往治療以及T細胞被癌細胞污染風險等因素的影響。為解決自體CAR-T細胞移植的挑戰(zhàn)，異體CAR-T細胞療法被作為一種潛在解決方案。異體療法提供了一種均質(zhì)化、標準化且易于獲取的選項，成本較低，且有可能實現(xiàn)多次給藥。更重要的是，異體CAR-T細胞療法可能特別適合用于侵襲性腫瘤，因為它消除了產(chǎn)品被惡性T細胞污染的風險。然而，異體移植的局限性包括GvHD的風險以及宿主介導的免疫排斥反應，即受者的免疫細胞攻擊輸注的CAR-T細胞，從而削弱其療效。

 

為緩解這些問題，已開發(fā)出多種策略。例如，可通過使用抗CD52抗體（如阿侖單抗）來消除宿主的CD52+異體反應性T細胞，這些細胞負責耗竭注入的CAR-T細胞。為此，必須在輸注前通過基因編輯破壞CAR-T細胞內(nèi)源性CD52的表達?；蚓庉嬤€可以靶向TCR和人類白細胞抗原（HLA），以進一步降低異體反應性。另一種策略是采集具有不同亞群的T淋巴細胞，例如攜帶γδTCR的T細胞，因為它們的細胞毒性比傳統(tǒng)用于CAR-T細胞產(chǎn)品的αβTCR更強。最后，重新輸注分化程度較低的細胞群體，如多能干細胞、前體T細胞或臍帶血細胞，可能會降低GvHD的風險。

 

T細胞富集方法

 

CAR-T細胞療法的起始材料是患者或供體的外周血單個核細胞（PBMCs）。PBMCs由70%-90%的淋巴細胞組成（其中包括70%-85%的CD3+T細胞、5%-10%的B細胞和5%-20%的NK細胞），單核細胞占10%-20%，樹突狀細胞（DCs）占1%-2%。PBMCs通過白細胞分離術(shù)或密度梯度離心從全血中分離出來，然后清洗以去除抗凝劑、紅細胞和血小板等雜質(zhì)。去除血小板至關(guān)重要，因為血小板可以與免疫細胞聚集，并表達可能被熒光抗體標記的Fc受體，從而在流式細胞術(shù)中導致假陽性結(jié)果。

 

CAR-T細胞生產(chǎn)的第二步是通過選擇性富集T細胞群體。當然，這一步是可選項。通常利用帶有抗體的磁珠進行陰選和陽選。比如，使用抗CD4/CD8或抗CD3抗體偶聯(lián)珠子。FDA批準的其中6種CAR-T中，3種采用的陽選。具體而言，Brexu-cel和Liso-cel是通過抗CD4/CD8抗體偶聯(lián)珠子進行陽選得到的，而Tisa-cel則是通過抗CD3/CD28抗體偶聯(lián)珠子進行陽選得到的。陽選需要注意的是，當細胞表面的受體被抗體結(jié)合時，細胞可能會接收到信號，從而改變其行為。比如，CD8和CD4的結(jié)合可以通過增加炎癥細胞因子的釋放和增強毒性，影響T細胞生物學，與CD3/CD28富集相比更為顯著。此外，CD3/CD28選擇還可以富集γδT細胞，而這些細胞由于表面缺乏CD4/CD8標記，會被CD4/CD8選擇排除。γδT細胞的重要性在于其與良好預后密切相關(guān)，并具有天然的抗腫瘤功能。

 

陰性選擇是富集T淋巴細胞的有效替代方法，與通過CD4/CD8陽性選擇獲得的CAR-T細胞相比，陰性選擇得到的CAR-T細胞在擴增、轉(zhuǎn)導效率和表型方面相似。該過程使用抗CD14、抗CD15、抗CD16、抗CD19和抗CD56抗體偶聯(lián)珠子的混合物，從PBMCs中去除單核細胞/巨噬細胞、粒細胞、NK細胞和B細胞，而T淋巴細胞則未受影響。陰性選擇已在臨床（如Cilta-cel）和臨床前研究中被使用。

 

由于T細胞是PBMCs的主要成分，許多團隊選擇直接刺激它們，而無需專門富集T細胞群體。這種方法的可行性也得到了FDA批準的CAR-T細胞產(chǎn)品（如Axi-cel和Ide-cel）的支持。下圖展示了FDA批準的其中6款CAR-T產(chǎn)品的體外富集方法。

 

體外T細胞激活和分化

 

T細胞激活

 

CAR-T細胞的生產(chǎn)通常包括三個步驟：激活、轉(zhuǎn)染和體外擴增，至少需要6天。在自然狀態(tài)下，CD8?和CD4?T細胞在與結(jié)合到MHCⅠ類或MHCⅡ類分子上的靶抗原相互作用后，會激活、增殖并分化為各種短壽命的效應亞群。在體外，可以通過使用游離的或包被在磁珠上的抗CD3/CD28抗體來實現(xiàn)T細胞的激活，其中后者是體外T細胞激活最常用的方法，占CAR-T細胞產(chǎn)品的66%。在6種FDA批準的CAR-T細胞產(chǎn)品中，有3種使用抗CD3/CD28抗體進行T細胞激活，分別是Brexu-cel、Axi-cel和Ide-cel。常見的磁珠與細胞（B:C）比例為3:1。

 

當T淋巴細胞通過與其對應抗原結(jié)合而被激活時，它們會上調(diào)并表達如CD25和CD69等表面標志物。CD25被認為是晚期激活的通用標志物，它是IL-2受體的一部分，在激活的淋巴細胞和調(diào)節(jié)性T細胞上高表達，其表達量與激活程度相關(guān)。而CD69在TCR/CD3結(jié)合后迅速誘導，被認為是早期激活標志物，在激活后30-60分鐘可檢測到，4-6小時后水平下降。

 

T細胞分化

 

細胞因子對CAR-T細胞的質(zhì)量和功能至關(guān)重要。IL-2、IL-7和IL-15影響T細胞的組成、質(zhì)量和表型，顯著影響CAR-T細胞療法的體內(nèi)療效。它們還可以在體外誘導T細胞增殖。IL-2已廣泛用于CAR-T細胞生產(chǎn)的制造方案中，包括FDA批準的療法，如Brexu-cel和Axi-cel（300U/mL）。其中，300U/mL和100U/mL是最常用的T細胞激活濃度，而較低的濃度如20U/mL、40U/mL、50U/mL和200U/mL也被使用。

 

盡管IL-2被廣泛使用，但它可能導致一種相對成熟的表型（CD62LlowCCR7+CD27+CD28+），這種表型更有利于調(diào)節(jié)性T細胞的擴增，而不是記憶T細胞。因此，選擇富含記憶細胞的群體，特別是記憶T干細胞（TSCM）至關(guān)重要。這些細胞在體內(nèi)表現(xiàn)出更好的持久性、定植能力和療效，與分化程度更高的表型（如效應T淋巴細胞）相比具有優(yōu)勢。TSCM的增強療效主要歸因于它們能夠像干細胞一樣進行多次細胞分裂，迅速生成高度增殖、自我更新、多能的后代細胞，這些細胞能夠快速對抗原產(chǎn)生響應。T細胞的增殖和存活與抗腫瘤療效和體內(nèi)持久性相關(guān)，故富集TSCM和中央記憶T細胞（TCM）是CAR-T細胞療法的研究重點?？梢酝ㄟ^在移植前限制T細胞的體外增殖以及刺激IL-7和IL-15受體來實現(xiàn)，這些受體可以減輕T細胞的終末分化，并增加記憶干細胞的比例。與用IL-2刺激的T細胞相比，用IL-7和IL-15刺激的T細胞表現(xiàn)出更低的耗竭標志物表達、更高的促炎細胞因子分泌以及更強的抗腫瘤效果。然而，這個方向目前還有一些爭議，促進TSCM富集的最佳細胞因子組合尚未明確。目前對于使用IL-7和IL-15也未沒有共識；一些團隊甚至報告說IL-2刺激可以誘導TSCM表型。此外，通過IL-7和IL-15刺激獲得的TSCM比例差異很大，范圍從10%-30%到60%-70%，這可能會影響CAR-T細胞的療效。

 

活化的T細胞轉(zhuǎn)染

 

病毒法轉(zhuǎn)染

 

病毒已經(jīng)成為CAR-T細胞基因改造的標準臨床方法。這種方法可以確保遺傳物質(zhì)整合到宿主細胞基因組中，實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染率和轉(zhuǎn)基因的長期穩(wěn)定表達。病毒載體主要有兩大類：γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)導分裂細胞，因此需要激活細胞，而慢病毒可以轉(zhuǎn)導分裂和靜止細胞。

 

在FDA批準的其中6種CAR-T細胞產(chǎn)品中，33%（Axi-cel和Brexu-cel）使用了γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒，而67%是基于慢病毒介導的轉(zhuǎn)導。

 

目前，沒有確鑿證據(jù)表明哪種病毒載體更好。病毒載體的一個主要問題是潛在的癌基因插入風險。然而，在臨床中尚未觀察到相關(guān)病例。此外，通過瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)慢病毒需要大量DNA，這會增加生產(chǎn)成本。慢病毒傾向于整合到轉(zhuǎn)錄活躍基因的內(nèi)含子中，從而降低了癌基因插入的風險。相比之下，γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒更傾向于整合到轉(zhuǎn)錄起始位點、增強子和啟動子附近。

 

非病毒法轉(zhuǎn)染

 

穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)移可以通過多種非病毒方法實現(xiàn)，包括轉(zhuǎn)座子、CRISPR/Cas9、mcDNA載體和納米顆粒（NPs）。

 

轉(zhuǎn)座子是能夠通過“剪切-粘貼”機制在基因組內(nèi)改變位置的DNA序列。這一過程依賴于轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座子攜帶目標基因，其兩側(cè)有反向末端重復序列，這些序列可被轉(zhuǎn)座酶結(jié)合。轉(zhuǎn)座子的優(yōu)點包括生產(chǎn)成本低、無需臨床級載體、能夠高效且永久地插入基因組，且比病毒方法更安全。此外，轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染可以在激活的和靜止的原代T細胞中進行。在最新一代的CAR-T細胞中，同時轉(zhuǎn)移多個基因至關(guān)重要，而轉(zhuǎn)座子特別適合這一目的，因為它們可以攜帶比病毒更大的遺傳物質(zhì)。然而，轉(zhuǎn)座子也有一些缺點，與病毒方法相比，生成CAR-T細胞所需時間更長，轉(zhuǎn)染效率較低。兩種最常用的轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)——SleepingBeauty(SB)和piggy-Bac——分別可實現(xiàn)25%-80%和20%-40%的T細胞轉(zhuǎn)染效率。

 

CRISPR/Cas9技術(shù)是轉(zhuǎn)座子的有前景的替代方法，可實現(xiàn)約20%-60%的CAR+細胞比例。該技術(shù)源自細菌和古菌的免疫系統(tǒng)，利用與目標DNA序列互補的短RNA片段（導向RNA或gRNA），引導Cas9酶到達這些特定序列。Cas9隨后切割原始DNA，利用細胞的DNA修復機制引入新基因。CRISPR/Cas9是一種簡單、靈活且精確的方法，可在基因組的預定位置整合多個轉(zhuǎn)基因。該技術(shù)當前的挑戰(zhàn)包括優(yōu)化和標準化基因編輯過程以提高穩(wěn)定性和效率，以及減少或消除最近發(fā)現(xiàn)的基因組編輯的后果——染色體丟失。

 

另一種有效的非病毒機制是使用CARmcDNA載體結(jié)合電穿孔將CAR結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染到T細胞中。這些mcDNA載體源自含有CAR序列的超螺旋親本DNA載體。在轉(zhuǎn)化到ZYCY10P3S2T大腸桿菌后，親本載體發(fā)生重組，產(chǎn)生兩個產(chǎn)物：CARmcDNA載體和一個包含細菌來源和抗生素基因的質(zhì)粒骨架。后者在培養(yǎng)基中加入L-阿拉伯糖后被I-SceI內(nèi)切酶降解。mcDNA載體的優(yōu)點包括由于缺乏殘留細菌成分而無免疫反應，且在細胞內(nèi)持久存在。通過mcDNA轉(zhuǎn)染可實現(xiàn)超過50%的轉(zhuǎn)染效率，超過慢病毒方法。然而，從質(zhì)粒中去除細菌成分可能復雜，且常導致產(chǎn)量低和細菌基因組DNA污染。

 

2017年，史密斯等人發(fā)表了一篇有趣的文章，展示了載有CAR編碼質(zhì)粒的聚合物納米顆粒在體內(nèi)誘導T淋巴細胞表達CAR的效率，其特異性由抗CD3抗體介導的納米結(jié)構(gòu)實現(xiàn)。此后，還出現(xiàn)許多其他平臺，包括脂質(zhì)納米顆粒、納米管和各種聚合物納米結(jié)構(gòu)。然而，納米顆粒并非沒有局限性。擴大生產(chǎn)工藝可能復雜，且必須認真考慮納米顆粒的潛在毒性。

 

CAR-T細胞的細胞毒性

 

評估CAR-T細胞體外殺傷能力的第一步是進行細胞毒性實驗。迄今為止，文獻中已經(jīng)描述了四種主要的實驗方法：鉻（51Cr）釋放實驗、流式細胞術(shù)（通過活/死細胞染色）、熒光素酶活性檢測以及細胞脫落（阻抗法）。每種方法都有其自身的優(yōu)缺點。

 

效應細胞與靶細胞（E:T）的比例是影響CAR-T細胞體外療效的最關(guān)鍵參數(shù)。文獻中已經(jīng)測試了多種E:T比例，例如1:1、3:1、5:1、10:1和20:1。這些研究評估了體外癌細胞的殺傷百分比以及細胞因子的釋放。由于抗原的差異、實體瘤與血液瘤的性質(zhì)不同以及CAR生成的具體情況，目前尚未就每種CAR-T細胞和癌細胞組合的最佳條件達成共識。通常，設(shè)置的E:T比例可導致血液和實體腫瘤細胞的殺傷率在40%到95%之間。

 

除了細胞毒性外，細胞因子定量是確定CAR-T細胞體外功能的最重要指標之一?？梢圆捎肊LISA檢測。最常被定量的細胞因子包括INF-γ、IL-2和TNF-α，以及GM-CSF和顆粒酶B。酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISpot）、流式細胞術(shù)和細胞內(nèi)染色（ICS）等方法也可以考慮。

 

引自：CAR-T Cell Manufacturing for Hematological and Solid Tumors: From the Preclinical to Clinical Point of View