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摘 要： 建立超高效液相色譜法同時(shí)測定香櫞中6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷和5，7-二甲氧基香豆素的含量。選擇HSS T3 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）為分析柱，以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流量為0.25 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為329 nm。6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、5，7-二甲氧基香豆素的質(zhì)量濃度分別在0.49～7.82、6.16～98.56、5.81～92.96、0.45～7.23 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，定量限分別為0.24、3.08、1.49、0.23 μg/mL。樣品加標(biāo)平均回收率為95.9%～98.1%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～1.8%（n=6）。該方法可用于香櫞藥材質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。

 

關(guān)鍵詞： 超高效液相色譜法； 香櫞； 6，7-二甲氧基香豆素； 橙皮苷； 香葉木苷； 5，7-二甲氧基香豆素

 

香櫞為蕓香科柑橘屬植物枸櫞Citrus medica L.或香圓Citrus wilsonii Tanaka的干燥成熟果實(shí)，具有疏肝理氣、寬中化痰的功效[1]。香櫞最早以“枸櫞”之名收載于《本草經(jīng)集注》中，附在豆蔻條下[2]； 《本草圖經(jīng)》在橘柚項(xiàng)下記載了枸櫞“如小瓜狀，皮若橙而光澤可愛，肉甚厚，切如蘿卜，雖味短而香氛，大勝柑橘之類，置衣笥中，則數(shù)日香歇”。“香圓”之名首見于《本草品匯精要》，主流基原為枸櫞，至明代《滇南本草》才以“香櫞”之名列出，其基原增加了香圓[2]。

 

香櫞為藥食同源品種，含有黃酮類、香豆素類、揮發(fā)油類、生物堿類和萜類等活性成分，其中黃酮類成分主要有柚皮苷、橙皮苷、香葉木苷、野漆樹苷、橙皮素等，香豆素類成分包括6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手苷內(nèi)酯、酯濱蒿內(nèi)酯、氧化前胡素等[3?8]。橙皮苷具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性[9]，香葉木苷具有抗炎、降糖、降壓和保護(hù)心肌等作用[10]，6，7-二甲氧基香豆素和5，7-二甲氧基香豆素均具有抗氧化、抗腫瘤活性[11]。

 

香櫞收載于國家標(biāo)準(zhǔn)始于《中華人民共和國藥典》1963年版， 《中華人民共和國藥典》 2020年版一部收載了香櫞藥材和飲片，藥材項(xiàng)下有性狀、鑒別、香圓的含量測定項(xiàng)目；飲片項(xiàng)下僅有性狀項(xiàng)目；枸櫞藥材和飲片項(xiàng)下均無含量測定項(xiàng)目。香櫞的常見偽品有小柚子、枳殼和佛手，其與香櫞飲片外觀性狀較近似，不易區(qū)分?，F(xiàn)行的香櫞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中涉及的檢測項(xiàng)目較少，需要不斷進(jìn)行完善，以更好地控制香櫞藥用質(zhì)量。目前，香櫞質(zhì)量控制研究主要集中在柚皮苷、橙皮苷的含量測定。香櫞的兩個(gè)基原香圓、枸櫞的化學(xué)成分存在一定差異，香圓的主要成分為柚皮苷，枸櫞的主要成分為橙皮苷[12?13]。吳笛等[14]研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)橙皮苷與5，7-二甲氧基香豆素的色譜峰面積的比值可簡便而準(zhǔn)確地區(qū)分佛手與枸櫞，但未測定二者含量。枸櫞種質(zhì)資源豐富，果實(shí)形態(tài)差異顯著，給鑒別及質(zhì)量控制帶來一定困難[15]。筆者以枸櫞為研究對象，通過優(yōu)化樣品處理?xiàng)l件和色譜條件，首次采用超高效液相色譜法同時(shí)測定了香櫞中6，7-二甲基香豆素、橙皮苷、香葉木苷和5，7-二甲基香豆素4種成分含量。該方法簡單、快速，準(zhǔn)確度高，可為香櫞質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)、資源開發(fā)利用等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：Acquity Class型，配有PDA檢測器、Empower工作站，美國沃特世公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-600GDV型，昆山市超聲儀器有限公司。

高速萬能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀有限公司。

電子天平：MS204TS型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

橙皮苷對照品、6，7-二甲氧基香豆素對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為97.2%、100.00%，中國食品藥品檢定研究院。

5，7-二甲氧基香豆素對照品、香葉木苷對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為98.80%、95.84%，成都普菲德對照品科技有限公司。

甲醇、乙腈：均為色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/span>

甲酸：優(yōu)級(jí)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用其余試劑均為分析純。香櫞樣品：經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院馬志國教授鑒定為蕓香科植物枸櫞Citrus medica L.的干燥成熟果實(shí)，市售。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：HSS T3 C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國沃特世公司)；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為0.1%甲酸溶液，流量為0.25 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL；檢測波長：329 nm。

表1   梯度洗脫程序

Tab. 1   Gradient elution program

1.3 溶液制備

1.3.1 系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

精密稱取6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、5，7-二甲氧基香豆素對照品適量，加入適量甲醇配制成質(zhì)量濃度依次為7.82、98.56、92.96、7.23 μg/mL的混合溶液，作為混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液。香葉木苷需先用二甲基亞砜溶解后，再加入甲醇稀釋定容。精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.625、1.25、2.50、5.00、7.50 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，搖勻，即得系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品溶液

取香櫞樣品粉末(過3＃篩)約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min (功率為500 W，頻率為40 kHz)，冷卻，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即為樣品溶液。

1.4 測定方法

取系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，按1.2色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中各成分的含量。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理?xiàng)l件選擇

取香櫞樣品粉末樣品，分別選用甲醇、60%甲醇溶液、乙醇為提取溶劑，考察不同溶劑對4種成分的提取效果，結(jié)果見表2。由表2可知，以甲醇作為提取溶劑時(shí)，提取效果較好；60%甲醇溶液提取效率次之；以乙醇為提取溶劑時(shí)，提取液色譜峰形較差。綜合考慮，選擇甲醇為提取溶劑。

表2   不同提取溶劑時(shí)4種成分的測定結(jié)果

Tab. 2   Determination results of 4 components in different extraction solvents

 

以甲醇為提取溶劑，分別考察超聲提取、加熱回流提取對4種成分的提取效果。結(jié)果表明，2種提取方式對4種成分的測定結(jié)果無明顯影響，超聲法簡單、方便。綜合考慮，選用超聲提取法。

以甲醇為提取溶劑，采用超聲提取法處理樣品，分別考察不同超聲時(shí)間(20、30、45 min)的提取效果，結(jié)果見表3。由表3可知，超聲30 min時(shí)可實(shí)現(xiàn)對4種成分的有效提取，故選擇超聲(功率為500 W，頻率為40 kHz)時(shí)間為30 min。

表3   不同超聲時(shí)間時(shí)4種成分的測定結(jié)果

Tab. 3   Determination results of 4 components at different ultrasonic time

 

2.2 色譜條件選擇

2.2.1 檢測波長

采用PDA檢測器，在200～400 nm范圍內(nèi)掃描樣品溶液，采集光譜圖。結(jié)果表明，6，7-二甲氧基香豆素分別在229、345 nm處有較大吸收，橙皮苷在284、329 nm處有較大吸收，香葉木苷在254、348 nm處有較大吸收，5，7-二甲氧基香豆素在255、329 nm處有較大吸收。綜合考慮吸收波長、各成分色譜峰面積、雜峰干擾等因素，確定檢測波長為329 nm，一方面可以保證各成分在該波長處有較大吸收，另一方面保證各成分色譜峰面積相對較大，提高檢測靈敏度，使測定結(jié)果更加準(zhǔn)確。

2.2.2 流動(dòng)相

分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%甲酸溶液3種流動(dòng)性體系，進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，4種目標(biāo)物的色譜峰分離效果、峰形較好，且基線較為平穩(wěn)，故選擇甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

2.2.3 柱溫

選用不同柱溫進(jìn)行試驗(yàn)，柱溫分別設(shè)定為25、30、35 ℃。在該溫度范圍內(nèi)，隨著柱溫升高，4種目標(biāo)物的色譜峰保留時(shí)間均逐漸縮短，峰形、峰面積、分離度均無明顯變化，3種溫度均能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。綜合考慮色譜峰分離效果、柱溫箱控溫效果等因素，選擇柱溫為30 ℃。

2.2.4 流量

選用不同流量進(jìn)行試驗(yàn)，流量分別設(shè)定為0.20、0.25、0.30 mL/min。當(dāng)流量為0.25、0.30 mL/min時(shí)，4種目標(biāo)物的色譜峰峰形、分離度均較好，當(dāng)流量為0.20 mL/min，4種目標(biāo)物的色譜峰峰形對稱性、分離度均降低。為減少流動(dòng)相用量，保護(hù)環(huán)境，選擇流量為0.25 mL/min。

2.2.5 色譜柱

分別選用HSS T3 C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)、CORTECS T3 C18柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)對4種目標(biāo)物的分離效果和色譜峰形進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)使用HSS T3 C18柱時(shí)，分離度、色譜峰形均較好，且基線較平穩(wěn)，因此選擇HSS T3 C18柱作為分析柱。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液，分別按1.2色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，在樣品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、5，7-二甲氧基香豆素保留時(shí)間一致，理論板數(shù)均大于5 000，分離度均大于2.0，表明系統(tǒng)適用性良好。

圖1   混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、香櫞樣品溶液色譜圖

Fig. 1   Chromatogram of mixed standard solution and sample solution of Citri fructus

1—6，7-二甲氧基香豆素； 2—橙皮苷； 3—香葉木苷；4—5，7-二甲氧基香豆素

2.4 線性方程與定量限

取系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，以對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。將質(zhì)量濃度最低點(diǎn)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用甲醇逐級(jí)稀釋，分別進(jìn)樣測定，以10倍信噪比(S/N)對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限。4種成分的線性范圍(質(zhì)量濃度)、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限見表4。由表4可知，4種成分在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表4   4種成分的線性范圍(質(zhì)量濃度)、線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量限

Tab. 4   Linear ranges (mass concentration)，linear equations，correlation coefficients，and quantification limits of four component

 

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.3.2方法制備樣品溶液，分別在第0、2、6、10、16、24 h，按1.2色譜條件進(jìn)行測定，記錄4種成分色譜圖，結(jié)果見表5。由表5可知，4種成分色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%、1.8%、1.9%、1.3%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

表5   穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 5   Stability test results

 

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

取香櫞樣品粉末，按照所建立的方法測定4種成分含量。然后取約0.25 g樣品，共6份，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液3 mL，按1.3.2方法制成加標(biāo)樣品溶液，在1.2色譜條件下測定，分別計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表6。由表6可知，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、5，7-二甲氧基香豆素加標(biāo)平均回收率分別為98.1%、96.9%、95.9%、97.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2%、1.1%、1.5%、1.8%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度。

表6   樣品加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 6   Results of samples spiked recovery and precision test

 

3 結(jié)論

建立了超高效液相色譜法同時(shí)測定香櫞中6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷和5，7-二甲氧基香豆素4種成分含量，對樣品處理?xiàng)l件、色譜條件等進(jìn)行了優(yōu)化。

(1) 該方法操作簡單，高效快速，準(zhǔn)確度高，能較好地對香櫞的藥用質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)和控制。

(2) 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)枸櫞中橙皮苷與5，7-二甲氧基香豆素的色譜峰絕對峰面積比值均大于1，與吳笛等[14]研究結(jié)果一致。橙皮苷與5，7-二甲氧基香豆素為區(qū)分枸櫞和佛手的2個(gè)差異性成分，根據(jù)橙皮苷與5，7-二甲氧基香豆素的色譜峰絕對峰面積比可以準(zhǔn)確地區(qū)分佛手和枸櫞，且該方法對不同產(chǎn)地、采收期的佛手與枸櫞具有較好的普遍適用性。

(3) 枸櫞為佛手的原變種，實(shí)際使用中存在二者混淆或互相代替使用的情況，研究結(jié)果可為枸櫞的基原鑒定、質(zhì)量控制和臨床使用提供參考。

(4) 采集的樣品均為枸櫞，具有較好的代表性。下一步擬采集較多香圓樣品，進(jìn)一步開展枸櫞和香圓化學(xué)成分差異性研究，為提高香櫞的藥用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

 

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