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背景

近年來，全球生物制藥發(fā)展迅速，市場規(guī)模龐大，在2018年全球藥品銷售額Top 10中，生物大分子藥占據(jù)8個席位，包括單抗藥物6個，融合蛋白2個，分別為阿達(dá)木單抗Humria（修美樂）、帕博利珠單抗Keytruda（可瑞達(dá)，“K藥”）、曲妥珠單抗Herceptin（赫賽?。?、貝伐珠單抗Avastin（安維?。⒗孜魡慰筊ituxan（美羅華）、納武利尤單抗Opdivo（歐狄沃，“O藥”）和依那西普 (Etanercept)、阿柏西普 (Aflibercept)。

我國的生物制藥也在緊跟腳步。企業(yè)如此，國家更是如此。NMPA意識到規(guī)范藥品市場準(zhǔn)入與藥品上市許可管理的重要性，近年陸續(xù)出臺了《生物制品注冊分類及申報(bào)資料要求(試行)》、《治療用生物制品注冊申報(bào)資料指南(試行)》，2020版《中國藥典》等，不斷更新完善生物藥品注冊申報(bào)的程序和資料，為企業(yè)研發(fā)提供規(guī)范且先進(jìn)的指導(dǎo)。政策開先河，企業(yè)也要跟上步伐。目前，國內(nèi)企業(yè)在在表征方法建立及數(shù)據(jù)解讀方面較弱，生物制藥分析表征和質(zhì)量控制方面還有待加強(qiáng)。具體而言，國內(nèi)生物藥企起步相對較晚，在生物制藥表征分析方法建立方面借鑒國外方法更多，還較少進(jìn)行新方法建立。特別是對于創(chuàng)新藥的新特征，如何找到一種合適的表征方法，常常沒有頭緒。面對成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物藥，如何從數(shù)據(jù)中找出樣品相關(guān)信息，判斷數(shù)據(jù)相關(guān)性和合規(guī)性，避免出現(xiàn)與預(yù)期不符的情況，是國內(nèi)生物藥企需要提高的地方。

表征分類

人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議ICH Q6B為生物技術(shù)產(chǎn)品的表征提供了一套統(tǒng)一的國際公認(rèn)原則，以支持單抗藥物的市場應(yīng)用。該文件建議進(jìn)行分析以提供有關(guān)生物或生物制藥產(chǎn)品的以下信息：

生物藥表征分析：

氨基酸序列

氨基酸組成

末端氨基酸序列

肽圖

巰基和二硫鍵

糖基化結(jié)構(gòu)

生物學(xué)活性等

工藝質(zhì)量分析對于生物制藥的生產(chǎn)至關(guān)重要，并且貫穿整個流程。在前期階段，生物制藥研發(fā)過程中需要分析測試，在工藝開發(fā)與放大過程中，更需要質(zhì)量控制把關(guān)。因此結(jié)構(gòu)確證研究是生物制品注冊申報(bào)資料的必備要素，以生物類似藥為例，需全面對比多批次穩(wěn)定中試工藝生產(chǎn)的原液和原研藥進(jìn)行的結(jié)構(gòu)分析，包括一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾和輔料等。

序列及結(jié)構(gòu)-色譜質(zhì)譜技術(shù)

使用反相高效液相色譜（RP-HPLC）和柱前衍生化技術(shù)進(jìn)行氨基酸組成分析，或者采用柱后衍生化處理的離子交換色譜法來確定生物制藥產(chǎn)品的氨基酸組成。

分子量

使用四極桿飛行時間質(zhì)譜對完整和還原的mAb進(jìn)行在線LC/ES-MS分析，徹底改變了以往完整分子量以及釋放的輕鏈和重鏈的測量方法。

氨基酸序列和多肽測定

以抗體藥為例，通過肽圖分析，氨基酸測序，質(zhì)譜分析等方法從DNA序列中推導(dǎo)氨基酸序列，并確認(rèn)DNA衍生序列。另外，N-末端氨基酸序列（是否存在游離氨基酸或焦谷氨酸）和C-末端氨基酸序列（例如，存在或不存在C-末端賴氨酸）的變異性，重鏈等）應(yīng)進(jìn)行分析。

圖1. LC/MS質(zhì)譜技術(shù)

而蛋白序列分析，就是圍繞以質(zhì)譜技術(shù)為主的分析方法。肽圖分析，使用特定蛋白消化酶，然后使用帶有紫外UV和電噴霧質(zhì)譜檢測、可提供有關(guān)分子量的信息。為了分析mAb輕鏈和重鏈序列，將許多蛋白酶消化物與在線RP-HPLC和串聯(lián)MS/MS（LC/ES-MS/MS）分析聯(lián)合使用。N端測序，由于質(zhì)譜的測序在大多數(shù)情況下無法區(qū)分異亮氨酸和亮氨酸（這些氨基酸具有相同的分子量），因此要明確分辨這兩個氨基酸，就需要對純化的肽在輕鏈和重鏈的可變區(qū)內(nèi)進(jìn)行自動N端測序。

末端氨基酸序列測定

進(jìn)行末端氨基酸分析以鑒定mAb輕鏈和重鏈的氨基和羧基末端氨基酸序列。如果產(chǎn)品顯示一個以上的末端氨基酸序列，則應(yīng)確定末端的相對量。使用Edman化學(xué)法進(jìn)行自動化的N末端測序，在蛋白質(zhì)的N末端具有游離的氨基官能團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記后，切割N末端和隨后的氨基酸。

巰基和二硫鍵測定

在肽圖分析測序分析中，還應(yīng)把游離巰基和二硫鍵考慮在內(nèi)。用特定蛋白酶消化后的肽圖分析，然后在還原前/還原后使用在線LC/ES-MS或LC/ES-MS/MS分析，可提供全面評估二硫鍵和游離基所需的mAb中的數(shù)據(jù)。

生物學(xué)活性-Biacore

在抗體體外生物學(xué)活行檢測項(xiàng)目中，抗體與抗原、Fcγ受體、FcRn以及Clq的親和檢測均需采用Biacore技術(shù)進(jìn)行申報(bào)。在美國FDA批準(zhǔn)上市的70多種抗體藥物中，80%都采用了Biacore技術(shù)完成了檢測和申報(bào)，Biacore也成為了中美日三國藥典收錄的互作分析技術(shù)。

藥效評價

抗體藥的藥效，不僅體現(xiàn)在Fab片段結(jié)合抗原的活性，還取決于其Fc片段，與Fcγ受體的相互作用，F(xiàn)cγ受體的親和力能夠作為藥物功效及半衰期的預(yù)測指標(biāo)。2013年 ，Roche針對 CD20靶點(diǎn)的單抗Gazyva獲批上市，用于慢性淋巴性白血病的治療。在申報(bào)材料中，Biacore技術(shù)用于Fcγ受體結(jié)合活性的測定 ， 結(jié)果顯示Gazyva比美羅華有更好的Fcγ RIII結(jié)合能力。

圖2. Biacore 技術(shù)檢測Inflectra和Remicade與 FcRn 的親和結(jié)果圖

一致性評價

一致性評價中關(guān)鍵一環(huán)是說明藥 物的生物活性和原研藥的相似性。在FDA生物類似藥指南中，Biacore技術(shù)是結(jié)合測定的首推方法。眾多企業(yè)在一致性評價中紛紛采用Biacore技術(shù)進(jìn)行了申報(bào)上市，如Zarxio、Inflectra以及Benepali等。Biacore獨(dú)創(chuàng)性地開了指紋圖譜比對功能，利用其可以直接進(jìn)行傳感圖細(xì)節(jié)比對并作出相似性打分，避免了由于擬合模型選擇等操作帶來的分析誤差，使結(jié)果更加直觀和準(zhǔn)確。

圖3. Biacore平臺獨(dú)創(chuàng)性指紋圖譜比對技術(shù)

生物活性質(zhì)量控制

抗體藥物由于分子量大 ，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物活性敏感，其工藝中每個環(huán)節(jié)的變化都可能導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量出現(xiàn)差異。因此企業(yè)應(yīng) 對抗體藥物工藝流程中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（特別是生物活性） 進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測、控制和放行?；贐iacore平臺可以建立全面的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，完成結(jié)合活性、活性濃度、翻譯后修飾和雜質(zhì)含量等的質(zhì)量控制。Biacore平臺可以實(shí)時監(jiān)控各工藝流程組分中抗體的生物活性，如細(xì)胞培養(yǎng) 、過濾 、 澄清等 ，活性有問題的抗體會出現(xiàn)解離加快、結(jié)合信號降低的現(xiàn)象 ，以幫助企業(yè)快速發(fā)現(xiàn)工藝中的問題。Biacore技術(shù)還可以用于最終產(chǎn) 品的批次放行，例如金賽藥業(yè)基于B iacore技術(shù)的生長激素蛋白批次放行標(biāo)準(zhǔn)獲得了中國食品藥品檢定研究院審批通過。

圖4. Biacore技術(shù)在藥物批次放行中的應(yīng)用