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食品在加工或存儲過程中，其中的糖類會因溫度的改變而與氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成醛類化合物。一些醛類化合物具有增色增香或改善食物特色風(fēng)味的功能；但一些糠醛類化合物會對人產(chǎn)生健康威脅，如食品中含有戊糖時，受熱時將產(chǎn)生5-羥甲基糠醛。據(jù)報道，糠醛類化合物普遍存在于熱加工處理后的食品中，如咖啡?？Х戎泻羞€原糖，在長時間的熱加工后極易產(chǎn)生糠醛類化合物，包括糠醛、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛等，其中5-羥甲基糠醛對上呼吸道黏膜等具有一定刺激作用。歐盟食品安全局的研究報告給出了這3種糠醛類化合物的每日參考攝入量，但目前我國尚無相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)要求。在我國咖啡消費量大幅持續(xù)增加的趨勢下，監(jiān)測咖啡飲品中的糠醛類化合物含量對于保障食品安全具有重要意義，因此有必要開發(fā)咖啡飲品中糠醛類化合物的檢測方法。

目前，已報道的食品中糠醛類化合物的檢測方法有分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜 -質(zhì)譜法等，其中氣相色譜 -質(zhì)譜法具有靈敏度高、分離效果好等優(yōu)點。相關(guān)前處理方法有固相萃取法、固相微萃取法、液液萃取法、液液微萃取法、QuEChERS等，但都有不足。研究人員綜合考慮各前處理方法的特點，擬采用碳酸鈉去除酸性雜質(zhì)，乙醇溶液提取，乙腈液液萃取置換，組合填料凈化，氣相色譜-質(zhì)譜法檢測，內(nèi)標(biāo)法定量分析糠醛、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛等3種糠醛類化合物，并將該方法應(yīng)用于 4類常見咖啡飲品咖啡豆 (粉 )、純速溶咖啡、多合一速溶咖啡和咖啡飲料的分析。

1 試驗部分

試驗樣品覆蓋了安徽省16種地市線下和線上常見類別國產(chǎn)品牌咖啡飲品，共 32份，其中樣品1#~5#為純速溶咖啡，6#~8#為咖啡飲料，9#~19#為咖啡豆（粉），20#~32#為多合一（包括二合一、三合一、四合一等，均簡稱多合一）速溶咖啡。在進行樣品處理前，咖啡豆先用中藥粉碎機或研磨機充分粉碎后裝在離心管中，在陰涼處保存；咖啡粉樣品直接稱量測定；速溶咖啡如果呈顆粒狀，需要先用中藥粉碎機粉碎再取樣測定；咖啡飲料需要先充分混勻再取樣測定。

試驗方法

提取

1）咖啡豆（粉）　稱取咖啡豆（粉）樣品，加入乙醇溶液和碳酸鈉溶液超聲，冷卻后用水定容，過濾，收集濾液至離心管內(nèi)，備用。

2）純速溶咖啡　稱取純速溶咖啡，加入乙醇溶液和碳酸鈉溶液，超聲，冷卻后用水定容，過濾，收集濾液至離心管內(nèi)，備用。

3）多合一速溶咖啡　稱取多合一速溶咖啡，加入乙醇溶液和碳酸鈉溶液，超聲，冷卻后用水定容，混勻備用。

4）咖啡飲料  取咖啡飲料，加入乙醇溶液和碳酸鈉溶液，超聲混勻，冷卻后用水定容，混勻備用。

液液萃取置換、凈化和測定

取上述樣品溶液 置于離心管中，加入 乙腈和混合內(nèi)標(biāo)溶液，充分混勻后渦旋，離心。取上清液置 于QuEChERS凈化管中，渦旋混合，離心，上清液按照儀器工作條件測定。當(dāng)測定值超出線性范圍時，需適當(dāng)減小稱樣量后再測定。不加樣品，同法進行試劑空白試驗，并扣除試劑本底。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件

試驗比較了規(guī)格相同的HP-FFAP、DB-WAX、HP-INNOWAX色譜柱的分離效果。結(jié)果顯示，3種糠醛類化合物在 HP-INNOWAX色譜柱上的峰形均較好，但是5-羥甲基糠醛在HP-FFAP色譜柱以及DB-WAX色譜柱上存在拖尾現(xiàn)象，因此試驗選擇采用HP-INNOWAX色譜柱作為固定相。

采用HP-INNOWAX色譜柱分離時，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品色譜圖中糠醛類化合物峰前均存在一個強雜質(zhì)峰；樣品色譜圖中5-甲基糠醛峰后普遍存在一個強雜質(zhì)峰，可能會對5-甲基糠醛定性產(chǎn)生干擾。為解決上述問題同時兼顧分析效率，試驗設(shè)定了一個較低的初始柱溫（50℃），并采用梯度升溫條件分離目標(biāo)物和雜質(zhì)。

2.1.2 提取條件

糠醛類化合物具有一定極性，可溶于無水乙醇、無水乙醚、丙酮等溶劑，因此試驗考察了提取溶劑分別為水、無水乙醇、50%乙醇溶液、無水乙醚、體積比1∶1的無水乙醚-石油醚混合溶液、丙酮、乙腈時對咖啡豆粉樣品中3種糠醛類化合物峰面積的影響，結(jié)果見圖1。

根據(jù)試驗結(jié)果，考慮到無水乙醚不易購買且刺激性較強以及乙腈提取后上機溶液中有較多干擾性雜質(zhì)，試驗選擇50% 乙醇溶液作為提取溶劑。

咖啡中含有有機酸等酸性雜質(zhì)，提取時以pH 12的堿性溶液處理有利于去除酸性雜質(zhì)，因此試驗比較了10%氨水溶液、10%碳酸鈉溶液、1%氫氧化鈉溶液、飽和氫氧化鈣溶液對咖啡豆（粉）樣品的處理效果，結(jié)果見圖2。

根據(jù)結(jié)果，試驗選擇10%碳酸鈉溶液作為堿性處理劑。

2.1.3 置換溶劑

樣品提取液是水溶液且含有部分雜質(zhì)，可能對氣相色譜柱產(chǎn)生一定損傷，因此需進行液液萃取以置換溶劑。試驗比較了分別以乙腈、丙酮、乙酸乙酯、無水乙醚、苯、正己烷作為置換溶劑時對加標(biāo)咖啡豆粉樣品中3種糠醛類化合物回收率的影響，結(jié)果見圖3。

結(jié)果顯示，以上6種溶劑均可用于置換樣品提取液中的目標(biāo)物，但是乙腈和苯的置換效率較高?？紤]到苯有一定危害性，試驗選擇乙腈作為置換溶劑。

2.1.4 凈化填料

采用單一QuEChERS填料 (C18、GCB、PSA或SCX) 凈化后發(fā)現(xiàn)，干擾峰信號強度降低但仍然存在。試驗進一步比較了分別以組合填 料100mgC18+50mgSCX、100mgC18+50mgPSA、400mgGCB+60mgPSA、50mgC18+50mgGCB+50mgPSA凈化時對加標(biāo)咖啡豆粉樣品中3種糠醛類化合物回收率的影響，每種組合填料均重復(fù)測定 3次，結(jié)果見圖4。

根據(jù)試驗結(jié)果，考慮到以100mgC18+50mgSCX凈化時，3種糠醛類化合物的回收率均較優(yōu)，試驗選擇該組合填料進行凈化。

2.2 方法學(xué)定性驗證

以保留時間和定性離子的相對豐度進行定性。相較標(biāo)準(zhǔn)品，樣品中目標(biāo)物的保留時間相對偏差的絕對值應(yīng)不大于5.0%，定性離子的相對豐度在>50%，>20%~50%，>10%~20%，≤10%時的允許偏差的絕對值應(yīng)不超過10%，20%，30%，50%。在優(yōu)化的儀器工作條件下，含內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見圖5。

2.3 方法學(xué)定量驗證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測定下限

取7個進樣瓶，分別加入10.0，20.0，50.0，100.0，200.0μL糠醛類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)使用液以及100.0，400.0μL糠醛類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，再分別加入混合內(nèi)標(biāo)溶液，用乙腈定容并按照儀器工作條件測定。以各糠醛類化合物和對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，糠 醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛的線性范圍均為0.050~9.92mg·L−1，線性回歸方程分別為y=0.5521x+0.02020、y=0.4315x+0.02300 和y=0.2138x+0.02690，相關(guān)系數(shù)分別為0.9998，0.9996，0.9997。

取提取的咖啡豆粉樣品溶液，用水稀釋制成咖啡豆粉樣品稀釋液，再用乙腈將咖啡豆粉樣品稀釋液稀釋 2，4倍，重復(fù)測定上述兩種樣品的乙腈稀釋液各3次并計算平均信噪比。以不小于3，10的信噪比分別估算檢出限和測定下限，糠醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛的檢出限分別為 0.002，0.002，0.003mg·kg−1，測定下限分別為0.006，0.006，0.010mg·kg−1。

2.3.2 精密度和回收試驗

4類咖啡飲品中均含有糠醛類化合物，選擇目標(biāo)物含量較低的咖啡豆粉樣品進行兩個濃度水平的加標(biāo)回收試驗，每個濃度水平平行測定6次，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗結(jié)果（n=6）

結(jié)果顯示，兩個濃度水平下3種糠醛類化合物的回收率為94.0%~107%，測定值的RSD為0.70%~ 2.2%。加標(biāo)量為1.50mg·L−1的咖啡豆樣品溶液的總離子流色譜圖見圖6。

2.4 樣品分析

為了驗證方法的適用性，按照試驗方法分析32份咖啡飲品，結(jié)果見表2。

表2 樣品分析結(jié)果

結(jié)果顯示，在32份樣品中均檢出了3種糠醛類化合物?？Х榷梗ǚ郏┛捎糜谥苽淦渌Х蕊嬈罚渲锌啡?、5-甲基糠醛含量整體高于其他類型咖啡飲品中的，5-羥甲基糠醛含量也較高且波動較大；純速溶咖啡中 3種糠醛類化合物總含量整體較高，且5-羥甲基糠醛含量占比最高，該研究結(jié)果和國外相關(guān)研究一致，這是由于純速溶咖啡中部分5-羥甲基糠醛來源于咖啡豆（粉）中糠醛的轉(zhuǎn)化，部分來源于熱加工過程轉(zhuǎn)化。考慮到我國暫無對于咖啡飲品中糠醛類化合物限量的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，而近年來我國人均咖啡攝入量增長較快，需進一步加強對咖啡飲品中5-羥甲基糠醛帶來的健康風(fēng)險的監(jiān)測。

3 試驗結(jié)論

研究人員在堿性條件下以50%乙醇溶液提取，乙腈液液萃取置換，組合填料凈化，氣相色譜-質(zhì)譜法檢測，內(nèi)標(biāo)法定量分析4種類型咖啡飲品中的糠醛、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛。該方法操作便捷，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度較好，可為咖啡飲品中糠醛類化合物的檢測提供較為實用的高靈敏度檢測方法。