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1976年單克隆抗體技術(shù)被Georges Köhler和 César Milstein發(fā)明，之后經(jīng)歷了鼠源、嵌合、人源化和全人源 4 個(gè)主要發(fā)展階段，由于鼠源和嵌合單抗會產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)，所以人源化和全人源單抗已成為生物技術(shù)企業(yè)研發(fā)的主流。單抗的分子量高達(dá) 150 kDa 左右，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其質(zhì)控相比較于小分子藥物要求更高。

以單抗技術(shù)為基礎(chǔ)，又相繼開發(fā)了抗體偶聯(lián)藥物、多特異性抗體藥物、納米抗體等多種新興技術(shù)，如何全面表征抗體藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，成為抗體藥物開發(fā)的關(guān)鍵點(diǎn)和難點(diǎn)。本系列文章分為上下兩篇，上篇重點(diǎn)是理化屬性，集中在抗體藥物結(jié)構(gòu)、電荷及分子量大小變異體、糖異質(zhì)性、工藝相關(guān)雜質(zhì)、聚集體分析，下篇重點(diǎn)為活性分析，包括結(jié)合活性和生物學(xué)活性等。

理化屬性表征

01抗體藥物結(jié)構(gòu)

抗體藥物結(jié)構(gòu)表征主要包括以下參數(shù)：

1)完整分子量

2)輕鏈分子量

3)重鏈分子量

4)氨基酸序列

5)二硫鍵

6)自由巰基

7)糖基化位點(diǎn)

8)N-端測序

9)翻譯后修飾

10)二、三級結(jié)構(gòu)表征

在前9項(xiàng)一級結(jié)構(gòu)表征中，LC/MS是最主要和最基礎(chǔ)的表征方法，二三級結(jié)構(gòu)涉及使用圓二色譜，紅外光譜等，細(xì)節(jié)不作贅述。

抗體結(jié)構(gòu)表征的目的，除了全面表征抗體藥物質(zhì)量，另外一個(gè)核心目標(biāo)是尋找可能影響抗體藥物療效的關(guān)鍵氨基酸殘基、關(guān)鍵氨基酸的翻譯后修飾，進(jìn)行相關(guān)工藝改造和確認(rèn)，避免在工藝開發(fā)后期以及臨床階段，產(chǎn)生不良影響，也是本文主要的討論內(nèi)容，主要包括：脫酰胺，異構(gòu)化，Met和Trp氧化，未配對的半胱氨酸等。

1.1 脫酰胺

天冬酰胺（Asn），尤其是CDR區(qū)的Asn殘基脫酰胺，是單克隆抗體藥物最常遇到的降解途徑之一。當(dāng)Asn后面是小的且活躍的甘氨酸（Gly）殘基（NG基序）時(shí)，容易發(fā)生脫酰胺，并且如果發(fā)生在CDR區(qū)，會導(dǎo)致對抗原結(jié)合親和力降低，抗體效力喪失。因而在抗體測序和生物信息學(xué)評估時(shí)，需要關(guān)注CDR區(qū)的Asn-Gly殘基，并在強(qiáng)制降解階段對其進(jìn)行評估。

此外在IgG的Fc段“ PENNY”環(huán)肽中，也包含脫酰胺易感位點(diǎn)，但是因?yàn)橥ǔ２粫贵w藥物結(jié)合抗原帶來負(fù)面影響，一般不做重點(diǎn)關(guān)注。

1.2 氨基酸氧化

蛋氨酸（Met）和色氨酸（Trp）殘基容易發(fā)生氧化。其中重鏈CDR2中的蛋氨酸以及Fc區(qū)中的蛋氨酸氧化并不會影響抗原結(jié)合。但是當(dāng)氧化水平較高，或者發(fā)生在抗原結(jié)合的關(guān)鍵CDR區(qū)域，會降低抗原結(jié)合能力，降低抗體藥物的有效性。

靠近CH2-CH3區(qū)域的蛋氨酸殘基易發(fā)生氧化，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性下降，聚集增加，補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC）下降，與FcRn的結(jié)合親和力下降以及體內(nèi)半衰期縮短。

CDR中Trp殘基的氧化，可能導(dǎo)致有效性降低，熱穩(wěn)定性降低和聚集傾向增加。

總體而言，生物信息學(xué)分析和一級序列測定時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注CDR區(qū)Met和Trp的氧化，并確定它們的敏感性，必要時(shí)在工藝階段采取適度控制策略。

1.3 Asp異構(gòu)化

Asp異構(gòu)化是單克隆抗體藥物的另一種降解途徑。CDR區(qū)的Asp殘基，如果后面是Gly殘基，His或Ser時(shí)，通常易于異構(gòu)化。CDR區(qū)發(fā)生異構(gòu)化，可能導(dǎo)致抗原結(jié)合親和力降低。當(dāng)pH值在5左右時(shí)，有利于Asp異構(gòu)化，因此抗體藥物的制劑配方開發(fā)時(shí)，需要注意其pH值盡可能避開5。

1.4 糖基化位點(diǎn)

IgG CH2 Asn-297連接的N糖為核心7糖結(jié)構(gòu)，四個(gè)N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和三個(gè)甘露糖(Mannose)殘基。根據(jù)抗體的功能需要，會對抗體的糖型進(jìn)行改造，以獲取相應(yīng)的功能特性，以及延長或縮短抗體半衰期等。因而糖基位點(diǎn)檢測分析貫穿于抗體藥物工藝的整個(gè)過程，也是質(zhì)量放行的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

▲Biologicals (2017)

抗體糖工程改造主要有巖藻糖基化，乙酰葡糖胺化，半乳糖基化，唾液酸化四種。

通過核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(Fut8)催化N-聚糖GlcNAc核心巖藻糖基化；通過乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶3(GNT3)在分支角Mannose上添加乙酰葡糖胺（GlcNAc）；通過β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶1(b4GALT1)在七糖末端的兩個(gè)GlcNAc添加半乳糖，使其半乳糖化。這三種策略是改變和1型FcγR的結(jié)合。在核心巖藻糖基化以及半乳糖基化的基礎(chǔ)上，在α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（ST6GAL1)，可以增加抗體的唾液酸化，唾液酸化則可以增加和2型FcγR的結(jié)合。

糖異質(zhì)性分析，通常使用LC/MS對于糖型進(jìn)行鑒定，使用HILIC-FLD進(jìn)行糖型定量分析，使用硼酸親和色譜進(jìn)行糖化檢測。

1.5 未配對的半胱氨酸（Cys）殘基

未配對的半胱氨酸會增加抗體的異質(zhì)性，并可能對化學(xué)和熱穩(wěn)定、生物功能、聚體形成，抗原結(jié)合效力和蛋白折疊產(chǎn)生重大影響。單克隆抗體在CDR區(qū)可能具有未配對的半胱氨酸（Cys）殘基，不過比較少見。未配對的Cys很容易地在細(xì)胞培養(yǎng)基中被游離的半胱氨酸修飾，會降低抗原結(jié)合親和力。因此，未配對的半胱氨酸應(yīng)視為質(zhì)量屬性進(jìn)行常規(guī)監(jiān)測和表征，以確保結(jié)構(gòu)完整性和產(chǎn)品質(zhì)量。

02變異體分析

重組抗體在培養(yǎng)工藝、純化、制劑等階段都容易引入抗體大小變異體和電荷變異體?？贵w大小變異體和電荷變異體是抗體鑒別和一致性評價(jià)的重要指標(biāo)。

大小變異體檢測常用方法包括分子量排阻色譜，CE-SDS（2015版藥典收錄，2020版做了修訂）。

抗體藥物的電荷變化反映了各種蛋白質(zhì)翻譯后修飾的總和，對工藝改變的過程非常敏感，在整個(gè)開發(fā)過程中都需要密切監(jiān)測，以確保一致性。常用的表征方法包括離子交換色譜法和等電聚焦法（2020版藥典收錄），檢測指標(biāo)包括等電點(diǎn)和酸堿變異體。

03聚集分析

抗體分子因?yàn)榉g后修飾、運(yùn)輸?shù)鹊募羟辛?、雜質(zhì)、pH值變化等引起蛋白質(zhì)空間改變，形成空間互補(bǔ)、電荷互補(bǔ)，易產(chǎn)生聚集體。聚集體（或聚集顆粒）是最常見的產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)?？贵w聚集會增加抗體藥物免疫原性，促進(jìn)抗藥物抗體產(chǎn)生，降低藥物療效，所以需要進(jìn)行密切監(jiān)控。

▲THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 2011

常用的分析方法包括：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）或毛細(xì)管電泳（CE-SDS），用于在變性條件下還原或非還原下測定mAb單體，片段和共價(jià)聚集體。體積排阻色譜法（SEC）也是確定單克隆抗體的高分子量聚集物（例如二聚體，三聚體或低聚物）的最常用方法。

對于大型聚集體（顆粒物），可以使用光散射來表征<1nm至1-10μm范圍內(nèi)的顆粒，比如常用的DLS方法，目前對于顆粒物，藥典的檢測方法包括光阻法（例如HIAC）和顯微計(jì)數(shù)法。微流體成像技術(shù)，則被用于大于2-100μm的顆粒物，可以一定程度上區(qū)分蛋白質(zhì)聚集顆粒物和其他異物。

04工藝相關(guān)雜質(zhì)

工藝相關(guān)雜質(zhì)，是指由生產(chǎn)工藝引入的雜質(zhì)，主要包括宿主細(xì)胞殘留的DNA和蛋白質(zhì)，以及純化時(shí)引入的蛋白A。宿主蛋白雖然不會引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)等副作用，但確是工藝（尤其是純化工藝）非常好的質(zhì)控指標(biāo)，所以一直是抗體藥物表征的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)。

宿主DNA最常用的方法是定量PCR法，而宿主蛋白殘留，一般推薦使用方法為ELISA法，但有時(shí)ELISA法的蛋白質(zhì)覆蓋度有不足，通常會結(jié)合使用質(zhì)譜法和特定蛋白質(zhì)的Western blot方法，以達(dá)到完整的覆蓋。對于殘留的蛋白A，通常使用ELISA法進(jìn)行檢測。

05一般屬性

除去上述關(guān)鍵的質(zhì)量參數(shù)，此外尚有pH值、滲透壓、外觀、粘度等指標(biāo)用于表征抗體藥物的一般屬性，可以參考藥典給出的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定。

小 結(jié)

抗體藥物因?yàn)榉肿恿渴切》肿铀幬锏臄?shù)百倍，且因表達(dá)體系，工藝流程容易引入蛋白質(zhì)翻譯后修飾變化，大小變異體，電荷變異體，甚至?xí)奂纬深w粒等，對于質(zhì)量表征提出了非常高的要求，本文分析了部分對于產(chǎn)品質(zhì)量，尤其是會影響最終療效的參數(shù)做了簡要的梳理。