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在RP-HPLC分析中，當(dāng)待分析物分子富含O、S、N等配位原子時(shí)，可能誘發(fā)“絡(luò)合效應(yīng)”，導(dǎo)致目標(biāo)色譜峰保留漂移或/和峰型異常（如分裂、拖尾）。本文結(jié)合筆者日常工作中遇到的實(shí)際案例、藥典及文獻(xiàn)報(bào)道，探討該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因及解決策略。所述為個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，如有疏漏，敬請同行指正。

2-吡啶甲酸衍生物絡(luò)合案例

某品種中2-吡啶甲酸衍生物殘留量檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)色譜峰裂分，且拖尾嚴(yán)重（如圖1所示），與歷史尖銳對稱現(xiàn)象不符。具體色譜條件為：色譜柱為封端C18（4.6*250mm，5μm）；流動(dòng)相為0.04mol/L磷酸氫二鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.0±0.2）-甲醇（80:20）；流速為每分鐘1.0ml；柱溫為30°C；檢測波長為264nm；進(jìn)樣量10μl；溶劑為流動(dòng)相。

圖1：2-吡啶甲酸衍生物檢測異常圖譜

通過實(shí)驗(yàn)，排除了色譜柱原因（如篩板堵塞導(dǎo)致溶質(zhì)繞流、色譜柱污染或柱效降低）、pH不適（pH未偏離待分析化合物pKa 1.5個(gè)單位）、殘存硅醇基次級作用導(dǎo)致峰型異常的可能。

考慮到2-吡啶甲酸衍生物中含吡啶氮和羧基氧，存在與金屬離子發(fā)生絡(luò)合配位的風(fēng)險(xiǎn)，可能造成2-吡啶甲酸衍生物峰型的畸變。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na) 是極強(qiáng)的金屬螯合劑，能與Fe³?，Cu²?，Al³? 等金屬離子競爭絡(luò)合，當(dāng)流動(dòng)相中添加該物質(zhì)后，能否改善峰型?將流動(dòng)相更換為0.04mol/L磷酸二氫鉀與0.5mmol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH為pH6.0 ±0.2）-甲醇（75:25），其他色譜條件不變，結(jié)果顯示裂分現(xiàn)象消失，峰型對稱（如圖2所示）。由此可以推斷造成峰型裂分拖尾的根本原因?yàn)?ldquo;絡(luò)合效應(yīng)”。

圖2：在原有流動(dòng)相中添加5mM乙二胺四乙酸二鈉后2-吡啶甲酸圖譜

為避免重新驗(yàn)證及方法變更，如何保證現(xiàn)行方法能夠繼續(xù)適用于日常檢測放行？通過減少色譜體系中的金屬離子浸出或/和通過掩蔽色譜體系中的金屬離子可能得以實(shí)現(xiàn)。

將色譜柱前后的不銹鋼管線更換為同內(nèi)徑同長度的Peek管（擬減少色譜體系中的金屬離子浸出），隨后采用10mM乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA-2Na) –甲醇（75:25）為沖洗劑，以1.0ml/min流速?zèng)_洗色譜系統(tǒng)3h（掩蔽色譜體系中的金屬離子），然后用現(xiàn)行操作規(guī)程中規(guī)定的流動(dòng)相平衡色譜體系40min后，重復(fù)進(jìn)樣考察加標(biāo)供試品中2-吡啶甲酸衍生物的峰型，結(jié)果表明目標(biāo)物在26h內(nèi)峰型正常，滿足現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，但拖尾因子呈增大趨勢，28h后峰型呈現(xiàn)裂分趨勢（如圖3所示）。

圖3：2-吡啶甲酸衍生物0h（上，峰型正常）及28h（下，呈現(xiàn)裂分趨勢）圖譜

羥基吡啶酮并吡嗪衍生物絡(luò)合案例

實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行羥基吡啶酮并吡嗪衍生物有關(guān)物質(zhì)分析方法開發(fā)時(shí)，采用30mM高氯酸鈉水溶液（每1000ml含高氯酸0.5ml）作為A相，乙腈作為B相，線性梯度洗脫，主物質(zhì)拖尾嚴(yán)重。將流動(dòng)相A更換為30mM高氯酸鈉與0.5mM乙二胺四醋酸二鈉水溶液（每1000ml含高氯酸0.5ml）后，峰型顯著改善（如圖4所示）。

圖4：羥基吡啶酮并吡嗪衍生物峰型

某喹諾酮類原料藥絡(luò)合案例

某喹諾酮類原料藥采用相應(yīng)的鹽酸鹽形式對照品進(jìn)行清潔取樣方法開發(fā)時(shí)發(fā)現(xiàn)聚四氟乙烯板材淋洗液主峰峰形正常，而鋁合金淋洗液主峰申舌甚至有裂分趨勢。選擇該喹諾酮類原料藥相應(yīng)的游離堿形式對照品進(jìn)行清潔取樣方法開發(fā)，聚四氟乙烯板及鋁合金板材主峰峰型均恢復(fù)正常（如圖5所示）。當(dāng)在流動(dòng)相中添加0.5mM乙二胺四醋酸二鈉后，繼續(xù)進(jìn)樣考察鹽酸鹽形式對照品對應(yīng)的淋洗液，峰型亦恢復(fù)正常。結(jié)合文獻(xiàn)[1, 2]可大致推斷出該喹諾酮類原料藥鋁合金淋洗液主峰異常的原因（如圖6所示）。

圖5：某喹諾酮類原料藥不同形式對照品淋洗液主峰峰型

圖6：某喹諾酮類原料藥鋁合金淋洗液主峰異常的原因推測

藥典專論絡(luò)合案例

通過檢索中國藥典專論，總結(jié)出會(huì)與金屬或金屬離子發(fā)生絡(luò)合的品種如下表所示。

“絡(luò)合”結(jié)構(gòu)匯總

當(dāng)待分析物分子富含O、S、N等配位原子時(shí)，有可能誘發(fā)“絡(luò)合”效應(yīng)，如四環(huán)素類藥物，其與金屬離子可能發(fā)生絡(luò)合的位點(diǎn)較多，如O10-O11、O11-O12、O12-O1、O1-N酰胺、O3-O酰胺、O3-N4以及O12a-N4[3]。如喹諾酮類藥物，其與金屬離子可能發(fā)生絡(luò)合的位點(diǎn)一般為O3-O4[1, 2]。

對于“絡(luò)合”導(dǎo)致的峰型異常應(yīng)對策略

上述案例均表明EDTA具備極強(qiáng)的金屬絡(luò)合作用，在進(jìn)樣前用其沖洗色譜系統(tǒng)及色譜柱，可以在一定時(shí)間內(nèi)保證金屬/金屬離子無法進(jìn)一步與目標(biāo)物絡(luò)合，但隨著不含EDTA流動(dòng)相的持續(xù)沖洗，EDTA屏蔽效應(yīng)會(huì)持續(xù)減弱直至消失（以2-吡啶甲酸衍生物為例，闡明內(nèi)在邏輯，詳見圖7）。一勞永逸的做法是直接在流動(dòng)相中添加強(qiáng)金屬絡(luò)合劑如EDTA。

圖7：2-吡啶甲酸衍生物色譜峰裂分/拖尾原因（絡(luò)合）及添加EDTA后峰型改善的作用機(jī)理示意圖

參考文獻(xiàn)

[1] Perez Guaita, D., Sayen, S., Boudesocque, S., et al., 2011. Copper(II) influence on flumequine retention in soils: macroscopic and molecular investigations. J Colloid Interface Sci 357, 453-459.

[2] TUREL I. The interactions of metal ions with quinolone antibacterial agents [J]. Coordination Chemistry Reviews, 2002, 223(1/2): 27-46.

[3] De Almeida W B, Dos Santos H F, Zerner M C. A theoretical study of the interaction of anhydrotetracycline with Al (III) [J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1998, 87(9): 1101-1108.