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摘 要： 建立蒽酮-硫酸分光光度法測(cè)定牛血漿試驗(yàn)液中的菊粉。在含有菊粉的血漿樣品中加入三氯乙酸除蛋白，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，取上清液過(guò)濾后進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定波長(zhǎng)為627 nm，蒽酮試劑用量為樣品溶液體積的10倍，于60 ℃水浴中顯色反應(yīng)10 min，樣品溶液稀釋至4倍體積。菊粉質(zhì)量濃度在25～150 mg/L范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.999 4，檢出限為1.49 mg/L。樣品加標(biāo)回收率為98.12%～101.53%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.74%（n=5）。該方法操作簡(jiǎn)單，適用于血漿試驗(yàn)液中菊粉的測(cè)定。

 

關(guān)鍵詞： 菊粉； 血漿試驗(yàn)液； 蒽酮-硫酸分光光度法

 

菊粉又稱(chēng)菊糖，主要來(lái)源于植物，是一種多糖聚合物，其相對(duì)分子質(zhì)量從幾百到幾千不等，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[1?2]。菊粉在醫(yī)藥領(lǐng)域可用作腎功能診斷劑[3?4]，菊粉的篩選系數(shù)主要用于評(píng)估高通量透析器對(duì)中分子物質(zhì)的清除能力。篩選系數(shù)是通過(guò)透析器濾出液溶質(zhì)濃度與透析器血液入口溶質(zhì)濃度及血液出口溶質(zhì)濃度計(jì)算而得，因此需要檢測(cè)試驗(yàn)液中菊粉的濃度。目前菊粉的檢測(cè)主要是針對(duì)農(nóng)作物中的菊粉，檢測(cè)方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、離子色譜法等[5?7]。分光光度法有3，5-二硝基水楊酸法、苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法[8?9]，高效液相色譜法[10?11]和離子色譜法[12?13]多數(shù)需要將菊粉通過(guò)強(qiáng)酸或者菊粉酶水解后進(jìn)行測(cè)定，且色譜法對(duì)儀器設(shè)備以及樣品處理的要求較高。

 

現(xiàn)行醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY 0053—2016《血液透析及相關(guān)治療　血液透析器、血液透析濾過(guò)器、血液濾過(guò)器和血液濃縮器》中規(guī)定了菊粉的篩選系數(shù)應(yīng)符合生產(chǎn)企業(yè)的規(guī)定，其首選試驗(yàn)液為抗凝牛血漿或者抗凝牛全血。有研究報(bào)道采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定動(dòng)物血清或尿液中的菊粉質(zhì)量濃度[14]，但關(guān)于血漿試驗(yàn)液中菊粉質(zhì)量濃度檢測(cè)方法的研究報(bào)道很少，有文獻(xiàn)報(bào)道采用微量比色法測(cè)定動(dòng)物血漿中的菊粉質(zhì)量濃度[15]，但該方法操作步驟繁瑣、試劑用量多，不利于進(jìn)行批量試驗(yàn)。筆者用三氯乙酸[16?17]對(duì)牛血漿樣品進(jìn)行預(yù)處理，除去血漿中的蛋白質(zhì)，采用蒽酮硫酸法測(cè)定其中的菊粉質(zhì)量濃度。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、試劑用量較少、準(zhǔn)確性好，為血漿中菊粉質(zhì)量濃度的測(cè)定提供了有效的檢測(cè)手段。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：Lambda 365型，美國(guó)珀金埃爾默股份有限公司。

低速臺(tái)式離心機(jī)：TDL-5-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

電子天平：SECURA224-1CN型，感量為0.1 mg，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)。

純水機(jī)：Synergy UV型，美國(guó)默克密理博有限公司。

渦旋混勻器：Vortex 3型，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司。

菊糖：生化試劑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

三氯乙酸、蒽酮：均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

硫酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

抗凝牛血漿：抗凝劑為檸檬酸鈉，廣州蕊特生物科技有限公司。

1.2 樣品處理

在抗凝牛血漿中加入一定量的菊粉(菊粉質(zhì)量濃度為300～400 mg/L)，充分?jǐn)嚢枞芙夂笞鳛橥肝銎骱Y選系數(shù)試驗(yàn)液，分別取透析器血液入口端、血液出口端、濾出液端的溶液作為樣品檢驗(yàn)液。在樣品檢驗(yàn)液中加入等體積的三氯乙酸溶液(1.2 mol/L，下同)，渦旋混勻，沉淀后離心30 min (轉(zhuǎn)速為3 000 r/min)，取上清液并過(guò)濾，濾液作為樣品待測(cè)液，此時(shí)樣品待測(cè)液中菊粉質(zhì)量濃度為150～200 mg/L)，置于4 ℃保存。

1.3 溶液配制

菊粉儲(chǔ)備液：1 000 mg/L，精密稱(chēng)取1 g菊糖，用純水溶解后轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用純水定容至標(biāo)線(xiàn)，混勻。蒽酮試劑：精密稱(chēng)取蒽酮0.28 g，溶于40 mL水與100 mL硫酸的混合液中，避光保存。菊粉系列工作溶液：將菊粉儲(chǔ)備液用水稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、250、300 mg/L的系列溶液，在系列溶液中分別加入等體積的三氯乙酸溶液，得到質(zhì)量濃度分別為25、50、75、100、125、150 mg/L的菊粉系列工作溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 方法原理

樣品檢驗(yàn)液中的多糖在硫酸作用下脫水生成糠醛，與蒽酮縮合成藍(lán)綠色糠醛衍生物，該物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色深淺與溶液中糖的濃度成正比[18]。利用反應(yīng)產(chǎn)物吸光度與糖濃度間的線(xiàn)性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對(duì)菊粉質(zhì)量濃度的定量測(cè)定。

1.4.2 樣品測(cè)定

以三氯乙酸水溶液(三氯乙酸溶液與純水體積比為1∶1)作空白參比，取200 μL菊粉系列溶液，分別加入2 mL蒽酮試劑，渦旋混勻后置于60 ℃水浴中反應(yīng)10 min，迅速冷卻至室溫，在627 nm波長(zhǎng)下依次測(cè)定菊粉系列工作溶液的吸光度，以溶液中菊粉質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。取100 μL 經(jīng)1.2處理后的樣品待測(cè)液，加入100 μL純水，混勻后加入2 mL蒽酮試劑，渦旋混勻，置于60 ℃水浴中反應(yīng)10 min，迅速冷卻至室溫，在627 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣品中菊粉的質(zhì)量濃度。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收波長(zhǎng)的選擇

不含三氯乙酸的菊粉溶液和含有三氯乙酸的菊粉溶液在可見(jiàn)光區(qū)的吸收光譜如圖1所示。

圖1   菊粉溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖

Fig. 1   UV-VIS absorption spectra of inulin solutions

由圖1可以看出，不含三氯乙酸和含有三氯乙酸的菊粉溶液均在627 nm波長(zhǎng)附近出現(xiàn)最大吸收峰，這與蒽酮-硫酸法測(cè)定水溶液中多糖含量的檢測(cè)吸收波長(zhǎng)在620 nm左右的研究結(jié)果相符[18?19]，表明三氯乙酸對(duì)菊粉溶液顯色反應(yīng)產(chǎn)物的吸收波長(zhǎng)無(wú)明顯影響，對(duì)吸光度影響也較小，因此，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為627 nm。

2.2 蒽酮試劑用量的確定

取250 mg/L的菊粉溶液100 μL，加入三氯乙酸溶液100 μL，分別加入蒽酮試劑1、2、4 mL (蒽酮試劑與測(cè)試液的體積比分別為5∶1、10∶1、20∶1)，渦旋混勻，其中加入1 mL蒽酮試劑的菊粉溶液出現(xiàn)渾濁，其余菊粉溶液按照1.4.2實(shí)驗(yàn)方法顯色反應(yīng)10 min后，加入2 mL蒽酮試劑的菊粉溶液呈較深的藍(lán)綠色，加入4 mL蒽酮試劑的菊粉溶液呈很深的藍(lán)綠色。在627 nm處測(cè)定吸光度，加入2 mL蒽酮試劑的菊粉溶液吸光度接近1.0，加入4 mL蒽酮試劑的菊粉溶液吸光度接近2.0。吸光度值過(guò)大可能會(huì)出現(xiàn)偏離朗伯-比爾定律的情況，測(cè)量誤差會(huì)增大，因此選擇蒽酮試劑的加入體積為2 mL，即蒽酮試劑的體積與測(cè)試液的體積比為10∶1。

2.3 顯色反應(yīng)時(shí)間的確定

取250 mg/L的菊粉溶液100 μL加入100 μL三氯乙酸溶液，加入蒽酮試劑2 mL，渦旋混勻，于60 ℃水浴中分別顯色反應(yīng)5、8、10、15、20 min，迅速冷卻至室溫，在627 nm波長(zhǎng)下分別平行測(cè)定3次吸光度，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，菊粉溶液的吸光度隨著反應(yīng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，反應(yīng)時(shí)間在10 min和15 min時(shí)吸光度差別不大，10 min時(shí)吸光度最大，因此選擇顯色反應(yīng)時(shí)間為10 min。

圖2   菊粉溶液在不同顯色反應(yīng)時(shí)間時(shí)的吸光度

Fig. 2   The absorbance of inulin solutions at different staining reaction times

2.4 測(cè)試液稀釋比例的選擇

取1.2中的樣品待測(cè)液100 μL，分別加入0、50、100、150、200 μL純水(相當(dāng)于樣品溶液分別稀釋至2、3、4、5、6倍體積)，對(duì)應(yīng)加入10倍體積的蒽酮試劑，按照1.4.2中實(shí)驗(yàn)方法顯色反應(yīng)10 min，迅速冷卻至室溫后，在627 nm波長(zhǎng)下分別平行測(cè)定3次吸光度，以平均值作為測(cè)定值，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，隨著樣品溶液稀釋倍數(shù)的增大，溶液吸光度逐漸減小。根據(jù)實(shí)際樣品的菊粉質(zhì)量濃度和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的最大濃度點(diǎn)，選擇吸光度在0.8左右為宜，因此確定將測(cè)試液稀釋至4倍體積。

圖3   菊粉溶液不同稀釋倍數(shù)時(shí)的吸光度

Fig. 3   The absorbance of inulin solutions at different dilution ratios

2.5 線(xiàn)性方程與檢出限

按照1.4.2方法測(cè)定菊粉系列溶液的吸光度，以溶液中菊粉質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為A=0.006 2ρ-0.015 7，相關(guān)系數(shù)為0.999 4，表明菊粉的質(zhì)量濃度在25～150 mg/L范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。在相同測(cè)試條件下，重復(fù)測(cè)定空白溶液20次，得到吸光度的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.003 07。根據(jù)國(guó)際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)的規(guī)定，檢出限為空白值的3倍標(biāo)準(zhǔn)差與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率之比，計(jì)算得該方法的檢出限為1.49 mg/L。

2.6 精密度試驗(yàn)

取菊粉篩選系數(shù)檢驗(yàn)液，按照1.2方法處理，得到的樣品待測(cè)液按照1.4.2測(cè)定吸光度，平行測(cè)定5次，精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1所示。由表1可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.74%，表明該方法具有良好的精密度。

表1   精密度試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 1   Results of precision test

 

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取菊粉篩選系數(shù)檢驗(yàn)液按照1.2方法處理，得到的樣品待測(cè)液按照1.4.2方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，冷卻至室溫，分別于第0、5、10、20、30、60、120 min測(cè)定吸光度，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.28%，表明樣品待測(cè)液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2   穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 2   Results of stability test

 

2.8 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

取菊粉篩選系數(shù)檢驗(yàn)液按照1.2方法處理，取7份處理后的樣品待測(cè)液，1份用于測(cè)定本底值，其余6份各加入50 mg/L含有三氯乙酸的菊粉溶液，按照1.4.2方法進(jìn)行處理和測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，菊粉的加標(biāo)回收率為98.12%～101.53%，平均回收率為99.55%，表明該方法測(cè)定血漿試驗(yàn)液中的菊粉質(zhì)量濃度具有良好的準(zhǔn)確性。

表3   樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 3   Results of samples spiked recovery rate

 

3 結(jié)論

(1) 采用蒽酮-硫酸分光光度法建立了牛血漿試驗(yàn)液中菊粉質(zhì)量濃度的測(cè)定方法，分別對(duì)顯色劑用量、測(cè)試液稀釋比例、顯色時(shí)間等檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳測(cè)定波長(zhǎng)為627 nm，選用顯色劑與測(cè)試液的體積比為10∶1，顯色時(shí)間為10 min，樣品測(cè)試液稀釋至4倍體積。

(2) 該方法使用的顯色劑用量較少、測(cè)定樣品需求量少、反應(yīng)時(shí)間較短，在不影響檢測(cè)準(zhǔn)確性的同時(shí)減少了檢測(cè)成本，檢測(cè)過(guò)程操作簡(jiǎn)便快捷、對(duì)硬件要求低、精密度高，可用于血漿試驗(yàn)液中菊粉的測(cè)定。

 

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