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摘 要： 建立一種基于分光光度法和快速圖像比色法雙模式測定堿性磷酸酶的分析方法。以四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和鄰菲啰啉（Phen）為顯色探針，在650 nm處測定樣品溶液的吸光度，以堿性磷酸酶濃度和吸光度繪制標準曲線。同時以氧化型TMB藍色的褪去及Fe3+和Phen配合物橙紅色的增強兩種顏色變化對應(yīng)的圖像RGB變化值對堿性磷酸酶濃度繪制標準曲線。在最佳條件下，吸光度和顏色強度均與堿性磷酸酶濃度在5～100 U/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.97、0.992，檢出限分別為0.35 U/L和5.5 U/L。吸收光譜法樣品加標回收率為99.19%～102.72%，測定結(jié)果的相對標準偏差為1.31%～4.01% （n=5）；圖像快速比色法樣品加標回收率為96.41%～105.2%，測定結(jié)果的相對標準偏差為1.81%～3.09% （n=5）。該方法滿足堿性磷酸酶現(xiàn)場快速檢測需要。

 

關(guān)鍵詞： 堿性磷酸酶； 抗壞血酸； Fe（Ⅲ）； 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺； 鄰菲啰啉； 智能手機比色

 

堿性磷酸酶(ALP)廣泛存在于哺乳動物的骨骼、肝臟、腸黏膜及淋巴等組織和器官中，可催化蛋白質(zhì)、核酸及小分子中多種磷酸酯的水解和去磷酸化。作為磷酸鹽代謝中的重要水解酶，人體血清中ALP水平異常與多種疾病包括骨骼疾病、糖尿病、肝功能不全和癌癥等密切相關(guān)[1?3]；此外，ALP常被用作酶聯(lián)免疫實驗中的標記酶，用于產(chǎn)生和放大檢測信號[4?6]，因此，建立簡單、靈敏、準確檢測ALP活性的分析方法對臨床診斷和生化分析都具有重要意義。目前檢測ALP的方法較多，主要有高效液相色譜法[7]、電化學(xué)法[8?9]、電化學(xué)發(fā)光[10]、吸收光譜法[11?12]、熒光法[13?15]等。其中，基于可見光吸收光譜和溶液顏色變化的可視化檢測法又稱目視比色法，它是一種通過對比或確定有色物質(zhì)溶液的顏色深淺來測定待測組分含量的方法[16?17]，該法可進一步結(jié)合智能手機用于現(xiàn)場快速檢測，非常適合儀器配置不足或經(jīng)濟相對落后地區(qū)的現(xiàn)場分析。筆者以3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和1，10-菲羅啉(Phen)為顯色探針，構(gòu)建了以Fe3+-TMB-Phen為顯色液檢測抗壞血酸和堿性磷酸酶活力的比色法。在Fe3+-TMB-Phen顯色液中加入ALP，可促使顯色液藍色褪去和橙紅色增強兩種顏色的變化，以及在650 nm處的吸收峰呈規(guī)律下降，可基于吸光度和顏色色度兩種模式對ALP進行定量。這種基于兩種信號對比獲得的檢測結(jié)果，大大提高了檢測結(jié)果的準確性和抗干擾能力。

 

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

紫外-可見分光光度計：UV-6000T型，上海元析儀器有限公司。智能手機：vivo x90型，預(yù)裝CS掃描全能王應(yīng)用軟件，維沃移動通信有限公司。電子天平：AE240型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。L-抗壞血酸鈉鹽(AA)、3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺、多巴胺、L-去甲腎上腺素、5-五羥色胺：均為分析純，西格瑪奧德里奇公司。L-抗壞血酸-2-磷酸鹽(AA-P)、鄰菲啰啉(1，10-菲羅啉)、鄰苯二酚、對苯二酚，尿酸、其他氨基酸：均為分析純，上海阿拉丁試劑公司。堿性磷酸酶(ALP，來源于小牛腸)、胰蛋白酶、溶解酵素和其他蛋白質(zhì)、胎牛血清：中美生物技術(shù)有限公司。實驗用水為超純水。

1.2 溶液配制

HEPES緩沖溶液：20 mmol/L，取HEPES (2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸) 47.60 mg，精密稱定，加入超純水溶解，用鹽酸和NaOH溶液調(diào)pH值至8.5，將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加水稀釋定容至標線，搖勻。NaAc-HAc緩沖溶液：20 mmol/L，取NaAc 16.40 mg，精密稱定，加入超純水溶解，用鹽酸和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至4.0，將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加水稀釋定容至標線，搖勻。AA標準儲備液：1×10-2 mol/L，取AA 19.81 mg，精密稱定，加入HEPES緩沖溶液10 mL溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至標線，搖勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。AA-P標準儲備液：1×10-2 mol/L，取AA-P 30.00 mg，精密稱定，加入HEPES緩沖溶液10 mL 溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容至標線，搖勻。現(xiàn)用現(xiàn)配。AA和AA-P系列標準溶液：精密量取AA或AA-P標準儲備液1、0.1、0.01 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，用HEPES緩沖溶液稀釋并定容至標線，搖勻，得到濃度分別為10-3、10-4、10-5 mol/L的系列標準溶液。Fe3+溶液、TMB溶液、Phen溶液：濃度均為1×10-2 mol/L，溶劑均為NaAc-HAc 緩沖溶液，配制方法同AA標準儲備液，現(xiàn)用現(xiàn)配。ALP標準溶液：5 000 U/L，用超純水溶解50 U ALP，將溶液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容至標線，搖勻。ALP系列標準溶液：精密量取ALP標準溶液1、0.1、0.01 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用HEPES緩沖溶液稀釋并定容至標線，搖勻，得到濃度分別為500、50、5 U/L的系列標準溶液。

1.3 樣品測定

1.3.1 分光光度法

依次向1.5 mL離心管中加入一定體積的NaAc-HAc緩沖液、Fe3+溶液、TMB溶液和Phen溶液，混勻反應(yīng)，待混合液顯色穩(wěn)定后，再加入一定體積的AA溶液，或AA-P溶液或其他干擾物溶液，使混合液最終總體積為500 μL，此時Fe3+、TMB和Phen的濃度分別為0.8、1、0.44 mmol/L，待顯色穩(wěn)定后，用手機相機拍照記錄溶液顏色，同時在650 nm波長處測定溶液的吸光度，得到紫外-可見吸收光譜。

將10 μL不同活力單位的ALP溶液加入到300 μmol/L AA-P溶液中，在37 ℃下溫育10 min，將上述混合液加入到Fe3+-TMB-Phen顯色液中，室溫下溫育，待顯色穩(wěn)定后，記錄溶液的顏色變化和吸收光譜。

1.3.2 圖像RGB值快速比色法

將顯色樣品溶液置于臺燈下方，臺燈高度為29.7 cm，使用手機軟件CS掃描全能王進行掃描，每次僅需拖動邊框確定掃描區(qū)域，即可獲得和掃描儀類似效果，故拍照距離對測定結(jié)果無影響。使用Adobe Photoshop圖像處理軟件中的顏色分析功能，在顯色區(qū)選擇5個相同大小的區(qū)域，讀取RGB 中藍色通道(即紅、綠、藍中藍色通道)的顯示圖像亮度值，基于顏色強度△R+△G與不同濃度的ALP依賴關(guān)系定量ALP。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3+-TMB-Phen顯色體系用于檢測AA和ALP的可行性分析

以Fe3+為氧化劑，將無色的TMB氧化生成藍色的oxTMB，oxTMB在650 nm處有最大吸收峰。將一定濃度的Phen加入到Fe3+-TMB顯色液中，溶液轉(zhuǎn)為墨綠色。在加入還原性物質(zhì)(如ALP催化產(chǎn)物AA)后，F(xiàn)e3+被還原為Fe2+，F(xiàn)e2+自發(fā)與Phen反應(yīng)生成Fe2+-Phen橙紅色配合物，oxTMB被還原性物質(zhì)還原，導(dǎo)致混合液墨綠色褪去，橙紅色增強。還原性物質(zhì)的加入促使650 nm處的吸光度呈規(guī)律下降，產(chǎn)生的Fe2+-Phen橙紅色配合物在510 nm處有最大吸光度，但其吸光度不隨還原性物質(zhì)濃度的增大呈規(guī)律變化，因此，可通過墨綠色的褪去和橙紅色的出現(xiàn)兩種顏色的變化，以及650 nm處的吸光度下降值定量還原性物質(zhì)?；诖?，建立一種組成為Fe3+-TMB-Phen的雙探針顯色體系，用于檢測ALP濃度。

如圖1所示，向Fe3+-TMB-Phen顯色液中加入ALP催化產(chǎn)物AA，隨著AA濃度的增加，混合液墨綠色褪去，橙紅色出現(xiàn)(圖1a)，在650 nm處的吸光度隨AA濃度升高成比例降低(圖1b)。AA濃度在5～200 μmol/L范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系，線性方程為A650=0.070 53cAA+0.003 72，相關(guān)系數(shù)R=0.994。檢出限為1.4 μmol/L。如圖2所示，向該顯色體系加入ALP催化底物AA-P，隨著AA-P濃度的增加，混合液顏色和650 nm處的吸光度未發(fā)生變化。以上結(jié)果表明，酶底物AA-P和產(chǎn)物AA加入到Fe3+-TMB-Phen顯色液中會產(chǎn)生不同的吸收響應(yīng)和顏色變化，可通過檢測ALP催化產(chǎn)物AA來定量ALP濃度。

圖1   加入不同濃度AA的Fe3+-TMB-Phen顯色溶液的顏色和吸收曲線

Fig. 1   Colors and UV-Vis absorption curves of Fe3+-TMB-Phen colorimetric solutions with different concentrations of AA added

圖（a）從左到右和圖（b）從上到下AA濃度依次為0、5、10、30、50、70、100、150、200 μmol/L

圖2   加入不同濃度AA-P的Fe3+-TMB-Phen顯色溶液的

Fig. 2   Colors and UV-Vis absorption curves of Fe3+-TMB-Phen colorimetric solutions with different concentrations of AA-P added

圖（a）從左到右和圖（b）從上到下AA-P濃度依次為 ；顏色和吸收曲線

0、10、30、50、70、100、150、200 μmol/L

2.2 實驗條件優(yōu)化

根據(jù)之前的研究經(jīng)驗，優(yōu)化了以下測定條件：Fe3+-TMB-Phen顯色液的底液為20 mmol/L NaAc-HAc 緩沖液(pH 4.0)，F(xiàn)e3+濃度為0.8 mmol/L，TMB濃度為1 mmol/L。在此基礎(chǔ)上，為提高Fe3+-TMB-Phen混合液檢測AA和ALP的靈敏度，分別對Phen濃度、ALP催化反應(yīng)底液的pH值和反應(yīng)時間進行了優(yōu)化。

在Fe3+-TMB溶液中加入不同濃度的Phen，觀察溶液顏色變化，結(jié)果如圖3a所示。由圖3a可以看出，隨著Phen濃度的增加，混合液顏色從藍色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，最終變?yōu)槟G色。當Phen濃度超過250 μmol/L時，混合液顏色保持為墨綠色，即當Phen濃度超過250 μmol/L時，混合液的顏色達到飽和。在上述溶液中加入100 μmol/L AA后，含440 μmol/L Phen的混合液顏色從墨綠色變?yōu)槌燃t色最為明顯(如圖3b所示)。由于Fe3+-TMB-Phen顯色液是基于顏色的變化來定量ALP，因此確定Phen的濃度為440 μmol/L。

圖3   不同Phen濃度時的溶液顏色

Fig. 3   Color of solutions with different concentrations of Phen

（a）圖和（b）圖中從左到右Phen濃度依次為0、60、120、180、250、320、380、440、500 μmol/L

為篩選ALP催化反應(yīng)底液的最佳pH值和最佳緩沖液，選取pH 5～pH 10的不同緩沖液(磷酸緩沖液，HEPES緩沖液，Tris-HCl緩沖液)為底液。結(jié)果表明，以pH值分別為6、7、8.5的HEPES緩沖液為底液時，體系顏色變化明顯；通過對比吸收光譜，當pH 8.5時吸光度下降最大，響應(yīng)值也最大，因此，選擇pH 8.5的HEPES緩沖液為ALP催化反應(yīng)的底液。

進一步對反應(yīng)時間進行了優(yōu)化，試驗結(jié)果如圖4所示。當Fe3+-TMB-Phen三者混合反應(yīng)3 min時，溶液顏色和650 nm處的吸光度趨于穩(wěn)定；向Fe3+-TMB-Phen混合液中加入AA，反應(yīng)5 min溶液顏色和吸光度趨于穩(wěn)定；ALP催化底物AA-P反應(yīng)10 min，即在37 ℃下溫育10 min，將ALP和AA-P的混合液加入到Fe3+-TMB-Phen顯色液中，反應(yīng)5 min，溶液顏色和吸光度趨于穩(wěn)定。由于該顯色體系具有較好的穩(wěn)定性，一旦溶液顏色和吸光度穩(wěn)定后，2 h內(nèi)幾乎不發(fā)生變化，所以選擇ALP催化反應(yīng)時間為10 min，其他每步反應(yīng)均在混合反應(yīng)10 min時記錄試驗數(shù)據(jù)。

圖4   不同反應(yīng)時間時的吸光度Fig. 4   Absorbance at different reaction times

2.3 專屬性

為考察以Fe3+-TMB-Phen顯色液檢測ALP催化產(chǎn)物AA的專屬性，在相同試驗條件下，分別將其他生理活性物質(zhì)(包括尿酸、去甲腎上腺素、多巴胺、葡萄糖、乳酸、5-羥色胺、谷氨酸、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚、牛血清白蛋白、組氨酸、谷氨酰胺、還原型谷胱甘肽、半胱氨酸等氨基酸)加入到Fe3+-TMB-Phen顯色液中，觀察溶液顏色和650 nm處的吸光度變化。結(jié)果表明，除5-羥色胺外，加入其他生理活性物質(zhì)，F(xiàn)e3+-TMB-Phen混合液顏色幾乎未發(fā)生變化，650 nm處的吸光度略微下降，這一結(jié)果說明其他生理活性物質(zhì)不干擾AA的檢測。如圖5所示，向該顯色體系加入5-羥色胺，隨著5-羥色胺濃度的增加，F(xiàn)e3+-TMB-Phen混合液藍色略微褪去，650 nm處的吸光度略微下降。由于200 μmol/L 5-羥色胺才能使Fe3+-TMB-Phen混合液在650 nm處的吸光度下降0.12，所以5-羥色胺對AA及ALP檢測不構(gòu)成干擾。

圖5   加入不同濃度5-羥色胺時Fe3+-TMB-Phen顯色溶液的

Fig. 5   Colors and UV-Vis absorption curves of Fe3+-TMB-Phen colorimetric solutions with different concentrations of 5-serotonin added

圖（a）從左到右和圖（b）從上到下5-羥色胺濃度依次為 ；顏色和吸收曲線

0、10、30、50、70、100、150、200 μmol/L

為考察以Fe3+-TMB-Phen顯色液檢測ALP的專屬性，在相同實驗條件下，分別將其他蛋白質(zhì)和酶(包括葡萄糖氧化酶、溶菌酶、胰蛋白酶、乙酰膽堿酯酶，濃度均為200 U/L；白蛋白、牛血清白蛋白，濃度為0.1 mg/mL)與AA-P混合后加入到Fe3+-TMB-Phen混合液中。結(jié)果表明，加入上述蛋白質(zhì)和酶后混合溶液在650 nm處的吸光度變化可忽略不計，且混合溶液未發(fā)生明顯的顏色變化，表明Fe3+-TMB-Phen顯色液對ALP的測定具有較好的專屬性。

2.4 線性方程與檢出限

按照1.3方法對ALP系列標準溶液進行測定，以ALP濃度為橫坐標(x)，以650 nm處的吸光度為縱坐標(y)，繪制標準工作曲線，計算得線性回歸方程y=0.002 52x+0.083 92，相關(guān)系數(shù)r=0.97。表明ALP濃度在5～100 U/L范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。按照1.3方法對空白溶液平行測定10次，計算標準偏差，以3倍標準偏差與標準工作曲線斜率的比值為檢出限，得檢出限為0.35 U/L。與我們之前建立的單探針Fe3+-TMB顯色體系相比(檢出限為0.05 U/L)，F(xiàn)e3+-TMB-Phen顯色體系的檢出限相對較高，但是，F(xiàn)e3+-TMB-Phen顯色體系可以避免大部分其他還原性物質(zhì)(如還原型谷胱甘肽、多巴胺和尿酸等)對AA和ALP檢測的干擾，相較Fe3+-TMB體系具有更高的選擇性。

ALP加入到Fe3+-TMB-Phen顯色體系中呈現(xiàn)墨綠色褪去和橙紅色出現(xiàn)兩種顏色的變化，按照1.3方法對ALP系列標準溶液進行測定，以ALP濃度為橫坐標(x)，以RGB中(△R+△G)值為縱坐標(y)繪制標準工作曲線，計算得線性回歸方程y=1.279x+3.215 2，相關(guān)系數(shù)r=0.992。表明ALP濃度在5～100 U/L范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。當顏色差異裸眼可區(qū)別，即(△R+△G)值大于空白值10時為檢測限，酶的檢出限為5.5 U/L。上述結(jié)果表明，所建立的雙探針比色法可通過吸光度和顏色RGB定量ALP活力。

2.5 樣品加標回收試驗

用HEPES緩沖溶液將胎牛血清稀釋至10倍體積。將不同濃度的ALP溶液分別加入胎牛血清稀釋液中，配制成不同活力單位的ALP加標血清樣品溶液，每個加標水平平行制備5份樣品溶液。將10 μL 不同活力單位的ALP加標血清樣品溶液加入到300 μmol/L AA-P溶液中，在37 ℃下溫育10 min，將上述混合液加入到Fe3+-TMB-Phen顯色液中，室溫下溫育，待顯色穩(wěn)定后，記錄反應(yīng)溶液的顏色變化并測定吸光度。分別采用分光光度計和圖像RGB值快速比色法對ALP加標樣品溶液進行檢測，以驗證方法的準確性，結(jié)果見表1。

表1   樣品加標回收試驗結(jié)果

Tab. 1   Results of samples spiked recovery testr

 

由表1可知，吸收光譜法樣品加標回收率為99.19%～102.72%，圖像快速比色法樣品加標回收率為96.41%～105.2%，表明兩種檢測模式均具有較高的準確度。將兩種模式的檢測結(jié)果進行對比，檢測結(jié)果絕對誤差不超過6.47 U/L，相對誤差不超過4.37%，表明快速圖像比色法的測定結(jié)果與吸收光譜法相比基本一致。兩種檢測模式的相對標準偏差均不大于4.01%，表明基于Fe3+-TMB-Phen顯色體系的兩種檢測模式均具有較高的精密度。

 

3 結(jié)語

建立了一種基于分光光度法和快速圖像比色法雙模式測定堿性磷酸酶活力。以四甲基聯(lián)苯胺和鄰菲啰啉為顯色探針，基于堿性磷酸酶的底物2-磷酸抗壞血酸與水解產(chǎn)物抗壞血酸不同的還原性，以650 nm處的吸光度變化和兩種顏色對應(yīng)的圖像RGB變化值對堿性磷酸酶濃度進行檢測，檢測結(jié)果靈敏度高，精密度好，準確度滿足分析要求。該方法簡單、快速，基于兩種信號對比獲得檢測結(jié)果，大大地提高了檢測的準確性和抗干擾能力，適用于堿性磷酸酶現(xiàn)場快速檢測。

 

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