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功能食品是一種不以治療疾病為目的的可實(shí)現(xiàn)特定人群功能化、精準(zhǔn)化營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充的特殊食品。功能食品中發(fā)揮核心作用的功能因子（如氨基酸、功能性糖類(lèi)、維生素、微量元素、益生菌、多糖及功能性脂類(lèi)等）需針對(duì)不同特殊人群的營(yíng)養(yǎng)需求進(jìn)行科學(xué)配比和精準(zhǔn)調(diào)控：對(duì)于易過(guò)敏人群，應(yīng)添加低致敏性的多肽或氨基酸等蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物；苯丙酮尿癥患者的功能食品必須嚴(yán)格控制苯丙氨酸（Phe）添加量；而早產(chǎn)兒配方食品則需要適當(dāng)提高精氨酸、胱氨酸、酪氨酸 (Tyr) 和牛磺酸等關(guān)鍵氨基酸的比例。作為蛋白質(zhì)的基本組成單位，氨基酸不僅參與組織代謝、生長(zhǎng)發(fā)育和損傷修復(fù)等生命過(guò)程，更是維持機(jī)體正常生理功能的重要代謝物。因此，建立功能食品中游離氨基酸的精準(zhǔn)定量分析方法具有關(guān)鍵意義。

目前，常見(jiàn)的氨基酸檢測(cè)方法有分光光度法、色譜法、毛細(xì)管電泳法、紅外吸收光譜法、氨基酸分析儀法和液相色譜-質(zhì)譜法。光譜法多用來(lái)測(cè)定氨基酸總量，對(duì)單個(gè)氨基酸難以精準(zhǔn)定量；氨基酸分析儀法作為氨基酸常規(guī)檢測(cè)方法，存在分析時(shí)間長(zhǎng)、樣品用量大、靈敏度較低等缺點(diǎn)；毛細(xì)管電泳法靈敏度低、重現(xiàn)性較差；色譜法往往需要衍生化來(lái)提高分離能力和靈敏度，且存在檢測(cè)效率低、應(yīng)用范圍較窄等缺點(diǎn)。基于此，研究人員建立了一種前處理簡(jiǎn)單、分析快速、基質(zhì)干擾小，靈敏度高的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，用于定量檢測(cè)功能食品中20種天然氨基酸。

1 試驗(yàn)方法

1.1 乳粉、米粉樣品

稱(chēng)取樣品置于離心管中，加入甲酸溶液（乳粉）或 （米粉），振蕩充分溶解，再加入乙腈 （乳粉）或（米粉）渦旋混勻。離心取上清液，加入正己烷，收集下層溶液，上層溶液再用正己烷萃取一次。合并下層溶液，用甲酸溶液稀釋?zhuān)^(guò)PTFE針式過(guò)濾器（Pall），濾液按照儀器工作條件測(cè)定。

1.2 功能飲料

功能飲料樣品用甲酸溶液稀釋?zhuān)瑴u旋混勻后過(guò)PTFE針式過(guò)濾器（Pall），濾液按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以連續(xù)流直接進(jìn)樣的方式將混合

標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀中進(jìn)行全掃描，以響應(yīng)值最高的準(zhǔn)分子離子為母離子，并優(yōu)化錐孔電壓使母離子響應(yīng)最佳。再對(duì)母離子進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，選擇響應(yīng)值較高且穩(wěn)定的子離子作為定量離子和定性離子，并優(yōu)化碰撞能量使特征子離子響應(yīng)最佳。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱

試驗(yàn)比較了ACQUITY UPLC® HSS T3、BEH C18、BEH Shield RP18、BEH HILIC等4種色譜柱的分離效果。根據(jù)結(jié)果，試驗(yàn)

選擇ACQUITY UPLC® HSS T3色譜柱作為固定相。

2.2.2 流動(dòng)相

試驗(yàn)進(jìn)一步考察了0.1%甲酸溶液-乙腈、0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的甲醇溶液、10mmol·L−1甲酸銨溶液-甲醇、水-甲醇體系作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)各氨基酸分離效果的影響。根據(jù)結(jié)果，

試驗(yàn)選擇0.1%甲酸溶液-含0.1%甲酸的甲醇溶液體系作為流動(dòng)相。

在優(yōu)化的儀器工作條件下，20種氨基酸的提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 乳粉、米粉樣品

功能食品基質(zhì)較為復(fù)雜，可能含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、色素等干擾物質(zhì)，影響氨基酸的準(zhǔn)確測(cè)定。試驗(yàn)采用蛋白質(zhì)含量較高的全脂奶粉為基質(zhì)，添加Gly 1500mg·kg−1、其余19種氨基酸15.0mg·kg−1，分別采用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅溶液、亞鐵氰化鉀-硫酸鋅溶液、15%三氯乙酸溶液、50%乙腈溶液等4種沉淀劑去除基質(zhì)干擾，并將沉淀后的樣品溶液稀釋10倍后過(guò)濾測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。

結(jié)果表明：4種沉淀劑去除基質(zhì)干擾的效果無(wú)明顯差異，個(gè)別氨基酸的回收率較低?？紤]到以上4種沉淀劑對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀效果較好但對(duì)糖類(lèi)化合物、脂肪等的去除效果有限，且非揮發(fā)性鋅鹽可能影響質(zhì)譜檢測(cè)，試驗(yàn)以加標(biāo)全脂奶粉為待測(cè)對(duì)象，進(jìn)一步比較了分別以15%三氯乙酸溶液和50%乙腈溶液沉淀后直接過(guò)濾測(cè)定（簡(jiǎn)稱(chēng)萃取前），稀釋10倍后過(guò)濾測(cè)定（簡(jiǎn)稱(chēng)萃取前稀釋10倍），正己烷萃取后過(guò)濾測(cè)定（簡(jiǎn)稱(chēng)萃取后），正己烷萃取后稀釋10倍并過(guò)濾測(cè)定（簡(jiǎn)稱(chēng)萃取后稀釋10倍）、正己烷萃取后過(guò)固相萃?。⊿PE）柱并過(guò)濾測(cè)定（簡(jiǎn)稱(chēng)萃取后SPE凈化）、正己烷萃取后超濾并測(cè)定（簡(jiǎn)稱(chēng)萃取后超濾），各種凈化方式所得的各氨基酸的回收率見(jiàn)圖3。

結(jié)果表明：相較其他凈化方式，萃取后稀釋10倍所得的各氨基酸的回收率分布較窄，其中以50%乙腈溶液作為沉淀劑的各氨基酸的回收率更優(yōu)（100%附近），說(shuō)明50%乙腈溶液凈化+正己烷萃取+10倍稀釋的凈化方式可有效去除樣品中蛋白質(zhì)、脂肪等的基質(zhì)干擾。因此，試驗(yàn)選擇該凈化方式去除乳粉、米粉樣品的基質(zhì)干擾。

采用正己烷萃取并進(jìn)行10倍稀釋后的樣品溶液中仍可能存在小粒徑顆粒物，直接進(jìn)樣容易損壞進(jìn)樣器并阻塞柱頭，因此試驗(yàn)選擇過(guò)濾后測(cè)定，并比較了分別以不同品牌CNW、Merck、Pall的PTFE或聚丙烯（GHP）針式過(guò)濾器過(guò)濾時(shí)含 Gly 10mg·L−1、其余19種氨基酸200μg·L−1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中20種氨基酸的回收率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

結(jié)果顯示：PTFE針式過(guò)濾器（CNW）、PTFE 針式過(guò)濾器（Merck）、PTFE針式過(guò)濾器（Pall）、GHP針式過(guò)濾器（Pall）所得的20種氨基酸的回收率依次為83.5%~101%、86.0%~106%、97.2%~107%、81.6%~107%，因此試驗(yàn)選擇對(duì)20種氨基酸吸附最小的PTFE針式過(guò)濾器（Pall）進(jìn)行過(guò)濾。

2.3.2 功能飲料

功能飲料樣品的基質(zhì)雖然較為簡(jiǎn)單，但是直接測(cè)定可能造成一定影響。試驗(yàn)以多肽型、維生素、運(yùn)動(dòng)型飲料加標(biāo)樣品為待測(cè)對(duì)象，比較了稀釋100倍后超濾測(cè)定以及稀釋1000 倍后直接測(cè)定（分別簡(jiǎn)稱(chēng)多肽型飲料稀釋100倍超濾、多肽型飲料稀釋1000倍、維生素飲料稀釋100倍超濾、維生素飲料稀釋1000倍、運(yùn)動(dòng)型飲料稀釋100倍超濾、運(yùn)動(dòng)型飲料稀釋1000倍）所得的各氨基酸的回收率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

結(jié)果顯示，將多肽型和運(yùn)動(dòng)型功能飲料直接稀釋100倍后超濾測(cè)定所得的L-Lys和His的回收率均在70.0%以下，而稀釋1000倍后直接測(cè)定所得的3種功能飲料中20種氨基酸的回收率均較優(yōu)，因此試驗(yàn)選擇將樣品稀釋1000倍的方式來(lái)降低功能飲料基質(zhì)對(duì)測(cè)定的影響。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

乳粉中存在的蛋白質(zhì)、脂肪等干擾物質(zhì)，易引起基質(zhì)效應(yīng)（ME），影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。分別用空白全脂奶粉樣品溶液、0.1%甲酸溶液作為稀釋劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按照儀器工作條件測(cè)定，分別繪制工作曲線(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并計(jì)算ME值，結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)ME值為負(fù)值時(shí)表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，為正值時(shí)表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)ME值絕對(duì)值大于50%時(shí)表示存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，在（20%，50%]內(nèi)時(shí)表示存在中等強(qiáng)度的基質(zhì)效應(yīng)，不大于20%時(shí)表示基質(zhì)效應(yīng)較低，可忽略不計(jì)。

結(jié)果表明，全脂奶粉中20種氨基酸的ME值絕對(duì)值均小于20%，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可以采用溶劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、檢出限和測(cè)定下限

按照儀器工作條件測(cè)定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

以3，10倍信噪比 (S/N) 計(jì)算檢出限（3S/N）和測(cè)定下限（10S/N），結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)全脂奶粉、乳蛋白深度水解配方食品、米粉、多肽型飲料、維生素飲料，以及運(yùn)動(dòng)型飲料等6種樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表4。

結(jié)果表明，20種氨基酸的回收率為78.4%~ 136%，測(cè)定值的RSD 為0.10%~14%，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，基本滿(mǎn)足分析要求。

2.7 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析市售常見(jiàn)的8種功能食品，結(jié)果見(jiàn)表5。

結(jié)果顯示，在8種功能食品中均未檢出Cys，其余氨基酸均有不同程度檢出。氨基酸配方食品和氨基酸代謝障礙配方食品中氨基酸總含量最高，米粉和其余乳粉次之，運(yùn)動(dòng)飲料中含量最低。

3 試驗(yàn)結(jié)論

研究人員通過(guò)優(yōu)化前處理?xiàng)l件、色譜條件和質(zhì)譜條件，提出了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量檢測(cè)功能食品中20種天然氨基酸的方法。該方法無(wú)需衍生化處理，前處理簡(jiǎn)單便捷，分析時(shí)間短，準(zhǔn)確度和靈敏度較高，適用于功能食品中20種天然氨基酸的定量分析，可用于特殊人群配方食品的開(kāi)發(fā)和監(jiān)管。