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摘 要： 建立了親水作用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法測(cè)定農(nóng)藥制劑中春雷霉素含量。在液體制劑和固體制劑樣品中加入水，超聲提取，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣測(cè)定。采用HILIC-Amide色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行分離，以0.2%甲酸溶液和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，外標(biāo)法定量。春雷霉素在該色譜柱上保留良好，分離效率高，在質(zhì)量濃度為50～1 000 mg/L內(nèi)，春雷霉素質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)與色譜峰面積的自然對(duì)數(shù)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。春雷霉素的定量限為50 mg/L，檢測(cè)限為1.0 mg/L。以春雷霉素液體制劑和固體制劑為樣品基質(zhì)，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.49%、0.51%（n=6），在不同添加水平下的平均回收率為99.5%和100.4%。在液相色譜分離時(shí)采用親水作用色譜柱，目標(biāo)化合物能夠獲得較好保留，同時(shí)采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，沒(méi)有特征紫外吸收的化合物也能得到較好的響應(yīng)。該方法適用于各種農(nóng)藥制劑產(chǎn)品中春雷霉素含量的測(cè)定，為農(nóng)藥制劑產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)提供了參考。

 

關(guān)鍵詞： 高效液相色譜法； 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器； 春雷霉素； 農(nóng)藥制劑

 

春雷霉素是農(nóng)、醫(yī)兩用抗生素，對(duì)人、畜、家禽急性毒性較低，隨著人們對(duì)化學(xué)農(nóng)藥安全性認(rèn)識(shí)的提高，春雷霉素作為高效、廣譜、低毒、無(wú)公害生物農(nóng)藥，展示了越來(lái)越光明的市場(chǎng)前景，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，目前，已有超過(guò)200種單劑或復(fù)配制劑產(chǎn)品取得了登記。春雷霉素特點(diǎn)為強(qiáng)極性、易溶于水，在液相色譜柱上保留時(shí)間短，與雜質(zhì)不能完全分離，給分析檢測(cè)帶來(lái)困難[1]。目前，文獻(xiàn)中報(bào)道的春雷霉素分析檢測(cè)方法包括高效液相色譜法[2?3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4?6]、毛細(xì)管電泳法[7]等。在使用常規(guī)液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通常需要加入離子對(duì)試劑，以增強(qiáng)其在色譜柱上的保留能力。

 

紫外檢測(cè)器是目前應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)器之一，其局限性在于僅能檢測(cè)具有紫外吸收的物質(zhì)，在面對(duì)組分復(fù)雜且需要進(jìn)行梯度分離的樣品時(shí)，使用紫外檢測(cè)器在低波長(zhǎng)條件下進(jìn)行分析，基線容易發(fā)生漂移，降低了定量分析的準(zhǔn)確性。相比之下，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)作為一種通用型檢測(cè)器，顯示了極大的優(yōu)越性[8]，能夠適用于復(fù)雜體系中多種成分的同時(shí)測(cè)定。該檢測(cè)器已廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域的化合物成分的分析，尤其在分析那些極性強(qiáng)、揮發(fā)性低、無(wú)紫外吸收或紫外吸收較弱的化合物方面，如氨基酸[9?10]、表面活性劑[11?13]、糖[14?15]、季銨鹽[16?17]等物質(zhì)的檢測(cè)，以及在藥物或中藥材分析[18?20]等領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用，為化合物成分分析提供了有力的技術(shù)支持。

 

春雷霉素由于缺乏特征性的紫外吸收，在應(yīng)用紫外檢測(cè)器進(jìn)行分析時(shí)，只能在低波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定。然而，春雷霉素在制劑中的含量通常低于其他輔助成分，導(dǎo)致了較多干擾物的存在。此外，春雷霉素的極性較強(qiáng)，易溶于水，很難通過(guò)改變流動(dòng)相的組成將其完全分離。相比之下，ELSD在檢測(cè)過(guò)程中能夠?qū)⒘鲃?dòng)相完全揮發(fā)，在梯度洗脫時(shí)基線更加平穩(wěn)。結(jié)合使用親水作用色譜柱，可以通過(guò)改變流動(dòng)相的組成及添加劑的種類(lèi)和濃度，對(duì)組成復(fù)雜的成分進(jìn)行有效分離。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，美國(guó)安捷倫科技有限公司公司。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：1260型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

氮?dú)獍l(fā)生器：NiGen LCMS 40-1型，意大利Claind公司。

超純水純化系統(tǒng)：Milli-Q型，德國(guó)默克股份兩合公司。

超聲振蕩器：2300T型，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

電子分析天平：MS205DU型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

離心機(jī)：TDL-5-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

春雷霉素鹽酸鹽對(duì)照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.9%，折算成春雷霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.5%，沈陽(yáng)沈化院測(cè)試技術(shù)有限公司。

甲酸、乙酸、乙酸銨：均為色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

乙腈：色譜純，德國(guó)默克公司。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：ChromCore HILIC-Amide柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，納譜分析技術(shù)(蘇州)有限公司]；流動(dòng)相：A相為0.2%甲酸溶液，B相為乙腈；流量：1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～2 min時(shí)B相體積分?jǐn)?shù)為95%，2～10 min時(shí)B相體積分?jǐn)?shù)由95%降至40%，10～15 min時(shí)B相保持體積分?jǐn)?shù)為40%；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

蒸發(fā)光檢測(cè)器參數(shù)：蒸發(fā)溫度：80 ℃；霧化溫度：80 ℃；霧化氣：氮?dú)猓惠d氣流量：1.6 L/min；增益值：1。

1.3 對(duì)照品溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.12 g (精確至0.000 1 g)春雷霉素鹽酸鹽對(duì)照品，置于100 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至100 mL，配制成春雷霉素質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400、800、1 000 mg/L的系列對(duì)照品溶液，過(guò)0.45 μm濾膜后測(cè)定。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 液體樣品的處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取含春雷霉素約0.02～0.06 g (精確至0.000 1 g)的試樣，置于100 mL容量瓶中，先加入80 mL超純水，超聲溶解5 min，冷卻至室溫，用水定容，過(guò)0.45 μm濾膜，作為樣品溶液。

1.4.2 固體樣品的處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取含春雷霉素約0.02～0.06 g (精確至0.000 1 g)的試樣，置于100 mL容量瓶中，先加入80 mL水，超聲溶解10 min，冷卻至室溫，用水定容，取10 mL試樣溶液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，在3 000 r/min的條件下離心3 min，取上清液過(guò)0.45 μm膜，作為樣品溶液。

1.4.3 樣品測(cè)定

按照儀器設(shè)定的條件，將系列對(duì)照品溶液和樣品溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄相應(yīng)的對(duì)照品溶液的色譜峰面積，以春雷霉素質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，春雷霉素色譜峰面積的自然對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)器的選擇

春雷霉素沒(méi)有特征的紫外吸收，在使用紫外檢測(cè)器時(shí)，僅能在較短波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果容易受到其他物質(zhì)的干擾。而質(zhì)譜檢測(cè)器雖然具有較高的靈敏度，但其對(duì)常量分析的準(zhǔn)確性較低，并且分析成本高昂，限制了其在實(shí)際應(yīng)用中的普及。相比之下，ELSD作為一種通用型檢測(cè)器，對(duì)春雷霉素展現(xiàn)了良好的靈敏度和穩(wěn)定性，并且能夠通過(guò)梯度洗脫技術(shù)進(jìn)行分離，有效解決干擾物對(duì)分離的影響，故選擇ELSD作為春雷霉素檢測(cè)的檢測(cè)器。

2.1.2 色譜柱的選擇

春雷霉素作為一種強(qiáng)極性化合物，在水中的溶解度較高。在常規(guī)的C18色譜柱上，春雷霉素保留性能較差，出峰較快，難以與樣品中的雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)有效分離。盡管通過(guò)在流動(dòng)相中引入離子對(duì)試劑可以增強(qiáng)其保留能力，但添加了離子對(duì)調(diào)節(jié)劑的流動(dòng)相缺乏揮發(fā)性，限制了使用ELSD進(jìn)行檢測(cè)的可能性。鑒于此，考慮采用對(duì)極性化合物保留較強(qiáng)的親水相互作用色譜柱。分別比較常規(guī)HILIC色譜柱和HILIC-Amide色譜柱的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在相同色譜條件下，春雷霉素在HILIC-Amide色譜柱上保留能力較好，對(duì)干擾物的分離也優(yōu)于常規(guī)的親水作用色譜柱，因此，選定HILIC-Amide色譜柱作為春雷霉素分析的色譜柱。

2.1.3 流動(dòng)相的優(yōu)化甲醇和乙腈為液相色譜分析時(shí)最常使用的有機(jī)溶劑，但是針對(duì)HILIC類(lèi)色譜柱，一般選用乙腈作為洗脫溶劑。使用任何比例的乙腈，色譜柱的背景壓力均適中，檢測(cè)的噪聲值也較低，基線穩(wěn)定，因此選擇乙腈作為有機(jī)流動(dòng)相。

ELSD需要選擇揮發(fā)性添加劑來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，從而調(diào)節(jié)目標(biāo)化合物的保留行為。比較了甲酸、乙酸、乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí)的分離效果，結(jié)果表明，采用甲酸作為流動(dòng)相的添加劑時(shí)，基線噪聲較低，基線平穩(wěn)，能夠獲得良好的保留時(shí)間和分離度。比較了添加不同體積分?jǐn)?shù)(0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)的甲酸溶液對(duì)分離和春雷霉素色譜峰面積的影響，當(dāng)流動(dòng)相中含有較低的甲酸時(shí)，響應(yīng)較高，但是色譜峰形較差，不利于定量分析，當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.2%時(shí)，色譜峰形對(duì)稱(chēng)，分離良好，且基線穩(wěn)定，因此選擇甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.2%。由于HILIC-Amide的洗脫能力與常規(guī)C18色譜柱相反，當(dāng)流動(dòng)相中乙腈含量較高時(shí)，春雷霉素有更強(qiáng)的保留，能夠更好與干擾物進(jìn)行分離，因此，選擇梯度洗脫程序進(jìn)行樣品中春雷霉素的色譜分離。

2.1.4 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器參數(shù)優(yōu)化

蒸發(fā)溫度、霧化氣溫度和霧化氣流量是影響ELSD的重要參數(shù)，對(duì)組分的保留時(shí)間影響較小，主要影響色譜峰的峰形、基線噪音及目標(biāo)化合物的響應(yīng)。當(dāng)蒸發(fā)溫度低于溶劑沸點(diǎn)時(shí)，流動(dòng)相無(wú)法充分揮發(fā)，造成基線水平升高，反之，若蒸發(fā)溫度過(guò)高，則可能引起較大的噪聲。

在載氣流量為1.6 L/min條件下，設(shè)定蒸發(fā)溫度分別為50、60、70、80、90、100 ℃，對(duì)春雷霉素色譜峰面積進(jìn)行了考察，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，當(dāng)蒸發(fā)溫度低于80 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，春雷霉素的色譜峰面積逐漸增大，當(dāng)達(dá)到80 ℃時(shí)，色譜峰面積趨于穩(wěn)定，基線平穩(wěn)，噪音低，因此，選用檢測(cè)時(shí)的蒸發(fā)溫度為80 ℃。

圖1   不同蒸發(fā)溫度對(duì)應(yīng)的春雷霉素色譜峰面積

Fig. 1   Chromatographic area of Kasugamycin corresponding to different evaporation temperatures

在優(yōu)化后的蒸發(fā)溫度條件下，進(jìn)一步探討了不同霧化氣流量(1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 L/min)對(duì)分離和春雷霉素色譜峰面積的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，在低載氣流量下春雷霉素色譜峰面積較大，而在較高的霧化氣流量下，色譜峰面積減小，同時(shí)噪聲也有所減少，這主要是因?yàn)闅怏w流量的變化會(huì)影響春雷霉素在氣相中的顆粒形成以及光散射效果，鑒于旨在對(duì)春雷霉素制劑進(jìn)行常量分析，對(duì)檢測(cè)靈敏度的要求并不高，綜合考慮春雷霉素的色譜峰面積與儀器噪音，最終選定載氣流量為1.6 L/min。

圖2   不同霧化氣流量對(duì)應(yīng)的春雷霉素色譜峰面積

Fig. 2   The chromatographic areas of Kasugamycin corresponding to different atomizing gas flow rates

2.2 色譜圖

圖3～圖5為在優(yōu)化的色譜條件下，對(duì)照品溶液、6%春雷霉素水劑、10%春雷霉素可濕性粉劑樣品的高效液相色譜圖。由圖3～圖5可以看出，春雷霉素樣品對(duì)春雷霉素的測(cè)定沒(méi)有干擾。

圖3   春雷霉素對(duì)照品溶液的高效液相色譜圖

Fig. 3   Chromatogram of the Kasugamycin reference solution

圖4   6%春雷霉素水劑樣品加標(biāo)后的高效液相色譜圖

Fig. 4   Chromatogram of the 6% Kasugamycin aqueous solution

圖5   10%春雷霉素可濕性粉劑樣品加標(biāo)后的高效液相色譜圖

Fig. 5   Chromatogram of the 10% Kasugamycin wettable powder

2.3 線性關(guān)系、定量限和檢出限

春雷霉素鹽酸鹽在水溶液中的存在形式為春雷霉素，因此，實(shí)際測(cè)定的是春雷霉素的色譜峰面積。將春雷霉素系列對(duì)照品溶液按照1.2儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)將1.3節(jié)配制的50 mg/L春雷霉素鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋?zhuān)瑫r(shí)測(cè)定，得到相應(yīng)濃度的色譜峰面積。春雷霉素質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)與色譜峰面積的自然對(duì)數(shù)呈現(xiàn)線性相關(guān)性，因此以春雷霉素的色譜峰面積(A)的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以春雷霉素質(zhì)量濃度(ρ)的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到相應(yīng)的線性回歸方程。當(dāng)春雷霉素的質(zhì)量濃度為50～1 000 mg/L時(shí)，春雷霉素的線性方程為lnA=1.383 9 lnρ-1.164 6，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，線性關(guān)系良好。當(dāng)春雷霉素的質(zhì)量濃度低于50 mg/L時(shí)，線性變差，相關(guān)系數(shù)降低，影響到定量的準(zhǔn)確性，因此，50 mg/L作為方法的定量限。同時(shí)，以最低質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣分析，并計(jì)算信噪比，以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限，檢出限為1.0 mg/L。鑒于農(nóng)藥制劑中春雷霉素的含量通常較高，通常以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，屬于常量分析范疇。當(dāng)樣品中春雷霉素的質(zhì)量濃度低于線性檢測(cè)范圍時(shí)，應(yīng)適當(dāng)增加取樣量，反之，若質(zhì)量濃度超出線性范圍，則需對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋后進(jìn)行測(cè)定，以確保定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確。

2.4 精密度試驗(yàn)

在我國(guó)，春雷霉素已經(jīng)登記的劑型主要有液體制劑和固體制劑，基于此，選取6%春雷霉素水劑和10%春雷霉素可濕性粉劑作為代表性樣品，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，試驗(yàn)中對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定。具體操作為，稱(chēng)取約0.4 g樣品(精確至0.000 1 g)，置于100 mL容量瓶中，按照1.4方法進(jìn)行樣品處理，隨后按1.2儀器條件進(jìn)行分析檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，6%春雷霉素水劑、10%春雷霉素可濕性粉劑測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.49%和0.51%，說(shuō)明該方法的精密度良好。

表1   春雷霉素樣品的精密度試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 1   Precision test results of Kasugamycin sample

 

2.5 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

鑒于無(wú)法獲取不含目標(biāo)化合物的空白樣本，筆者采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行實(shí)際樣品的加標(biāo)回收試驗(yàn)，選擇6%春雷霉素水劑和10%春雷霉素可濕性粉劑樣品(樣品中春雷霉素的本底值根據(jù)表1的測(cè)定結(jié)果確定)，稱(chēng)取約0.2～0.3 g (精確至0.000 1 g)的樣品，置于100 mL容量瓶中，隨后加入約含0.01 g春雷霉素鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加濃度進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)，按1.3進(jìn)行樣品處理，按1.4進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，6%春雷霉素水劑樣品、10%春雷霉素可濕性粉劑樣品的加標(biāo)平均回收率分別為99.5%、100.4%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。

表2   春雷霉素樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

Tab. 2   Test results of spiked recovery of Kasugamycin samples (n=6)

 

以上結(jié)果說(shuō)明，在50～1 000 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，春雷霉素質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)與峰面積的自然對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9，方法的重復(fù)性、精密度、準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果均符合農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2887—2016《農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量分析方法確認(rèn)指南》的要求，表明該方法能夠滿足春雷霉素樣品中含量的定量檢測(cè)需求。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

從上海農(nóng)資流通市場(chǎng)采購(gòu)了6種不同含量及劑型的春雷霉素樣品，按照所建立的方法對(duì)樣品中的春雷霉素含量進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)于固體制劑，參照GB/T 34761—2017《春雷霉素可濕性粉劑》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定；對(duì)于液體制劑，參照GB/T 34774—2017《春雷霉素水劑》進(jìn)行了測(cè)定，測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3   實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

Tab. 3   Actual sample test results

由表3可見(jiàn)，該方法與國(guó)標(biāo)方法的測(cè)定結(jié)果相比差別不大，說(shuō)明測(cè)定的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

 

3 結(jié)語(yǔ)

將親水作用色譜柱分離技術(shù)與蒸發(fā)光散射檢測(cè)器相結(jié)合，成功建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法直接測(cè)定春雷霉素制的劑含量。通過(guò)優(yōu)化HILIC色譜柱的分離條件，有效解決了作為強(qiáng)極性物質(zhì)的春雷霉素在制劑中的分離難題，同時(shí)，采用蒸發(fā)光散射器檢測(cè)，克服了春雷霉素?zé)o特征的紫外吸收，只能在低波長(zhǎng)檢測(cè)的缺陷。該方法已成功應(yīng)用于春雷霉素水劑、可溶液劑、可濕性粉劑等制劑中春雷霉素單劑或復(fù)配制劑樣品的分離檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)便、快速高效的特點(diǎn)，為農(nóng)藥制劑中春雷霉素含量的質(zhì)量控制提供了一種可靠的分析手段。

 

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