本文通過(guò)研究生物制藥核心設(shè)備，本研究系統(tǒng)剖析生物反應(yīng)器、層析系統(tǒng)、超濾裝置等相關(guān)生物制藥核心設(shè)備的設(shè)計(jì)驗(yàn)證原則，探究了離心、層析、膜分離等相關(guān)分離純化技術(shù)的工藝優(yōu)化路徑。通過(guò)離心-過(guò)濾、連續(xù)流層析、多模式層析的技術(shù)聯(lián)用策略，提出：設(shè)備端應(yīng)用層析柱裝柱均一性，其中HETP≤2倍粒徑的方式則可以有效預(yù)防溝流；技術(shù)端主要應(yīng)用連續(xù)流層析則可以有效提高綜合性能，而基多模式層析（Capto MMC）載量達(dá)80 g/L。因此，在生物制藥設(shè)備以及分離純化技術(shù)應(yīng)用中，要綜合實(shí)際狀況，探究現(xiàn)代化技術(shù)手段，旨在構(gòu)建高效、穩(wěn)健、合規(guī)的生產(chǎn)體系。
Part.01前言
生物制藥行業(yè)在發(fā)展中要聚焦設(shè)備運(yùn)行瓶頸以及分離技術(shù)局限等因素，通過(guò)集成設(shè)備創(chuàng)新化技術(shù)手段，利用模塊化工廠、預(yù)測(cè)性維護(hù)等多種方式進(jìn)行動(dòng)態(tài)管理。通過(guò)離心-深層過(guò)濾-MCCS、數(shù)字化管理等方式進(jìn)行技術(shù)聯(lián)合，則可以構(gòu)建高效化、規(guī)范化以及標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)體系。
通過(guò)相關(guān)研究可以發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)于生物制藥設(shè)備和分離純化技術(shù)的相關(guān)研究較多。其中，姚中華[1]的研究聚焦運(yùn)營(yíng)階段問(wèn)題，提出了安全管理依賴通用SOP、備份忽略關(guān)鍵參數(shù)，例如軟件配置、缺乏風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)回顧機(jī)制。基于實(shí)際狀況提出了"軟件+參數(shù)+數(shù)據(jù)"全備份、動(dòng)態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估周期的優(yōu)化方案。而裘宗祺[2]重點(diǎn)研究了實(shí)驗(yàn)設(shè)備管理效益，提出全生命周期數(shù)字化管理：采購(gòu)階段量化利用率，其中預(yù)約率≥90%，維護(hù)階段用傳感器預(yù)測(cè)故障，有效降低了30%，開(kāi)發(fā)B/S平臺(tái)降低閑置率，其中為35%→12%。王駿[3]研究的重點(diǎn)是設(shè)備與分離純化技術(shù)，通過(guò)對(duì)生物反應(yīng)器、層析系統(tǒng)的分析，了解其驗(yàn)證要點(diǎn)，及離心、超濾、層析等技術(shù)原理與應(yīng)用，強(qiáng)調(diào)疫苗/血制品生產(chǎn)中的質(zhì)量控制。而張磊、王明[4]研究的重點(diǎn)則是設(shè)備故障預(yù)防，通過(guò)基于六西格瑪DMAIC模型：Define故障KPI→Measure振動(dòng)/溫度數(shù)據(jù)→Analyze高風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)→Improve維護(hù)計(jì)劃，結(jié)合LSTM預(yù)測(cè)故障，其準(zhǔn)確率92%。
王若谷[5]實(shí)現(xiàn)了技術(shù)整合與裝置創(chuàng)新 ，提出了優(yōu)化連續(xù)流層析，省時(shí)40%左右。離心-過(guò)濾聯(lián)用，其提速50%；開(kāi)發(fā)集成裝置，利用離心甩渣+兩級(jí)過(guò)濾+蒸餾提純的方式進(jìn)行處理，PLC自動(dòng)控制實(shí)現(xiàn)99.9%純度。
生物制藥設(shè)備始終貫穿整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程，在上游發(fā)酵/細(xì)胞培養(yǎng)、下游分離純化、制劑灌裝等各個(gè)流程中具有重要的作用，在應(yīng)用中其要點(diǎn)必須要保障可以有效滿足生物藥生產(chǎn)的要求。
2.1 材料兼容性與生物相容性
保障生物制藥設(shè)備與物料接觸的部分，例如管道、罐體、濾膜、色譜柱等必須要根據(jù)技術(shù)要求，應(yīng)用惰性、無(wú)毒、無(wú)浸出物且無(wú)吸附性的材料，其主要包括316L不銹鋼、特定聚合物以及玻璃等材質(zhì)。材料與產(chǎn)品、緩沖液以及清洗劑等必須要根據(jù)要求進(jìn)行兼容性測(cè)試，重點(diǎn)評(píng)估浸出物延長(zhǎng)可提取物對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量、安全性等產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)隱患，強(qiáng)化生物負(fù)載控制。
2.2 無(wú)菌性與密閉性
重點(diǎn)要防止微生物、內(nèi)毒素、外來(lái)微粒污染。因此，在設(shè)備的設(shè)計(jì)中要應(yīng)用便于清潔、滅菌，始終保障無(wú)菌狀態(tài)。在研究中要重點(diǎn)做好無(wú)死角、容易排水的無(wú)菌設(shè)計(jì)?；谇鍧嶒?yàn)證（CIP）、滅菌驗(yàn)證（SIP）方案對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化處理。例如，可以通過(guò)一次性使用技術(shù)（SUT）進(jìn)行驗(yàn)證處理。而通過(guò)密閉系統(tǒng)操作，可以合理利用無(wú)菌連接、斷開(kāi)技術(shù)進(jìn)行處理。
2.3 可清潔性
設(shè)備設(shè)計(jì)要保障符合要求，便于清潔，可以有效去處除殘留物，避免出現(xiàn)交叉污染以及微生物滋生等問(wèn)題。
在研究中，要將表面光潔度作為重點(diǎn)，基于CIP系統(tǒng)設(shè)計(jì)，優(yōu)化噴淋球覆蓋率、流速、壓力等參數(shù)。根據(jù)要求確定清潔劑以及效果，保障符合設(shè)計(jì)要求。
2.4 自動(dòng)化與過(guò)程控制
在設(shè)計(jì)中充分提高工藝一致性，有效減少效率以及人為操作的錯(cuò)誤。通過(guò)智能化技術(shù)進(jìn)行處理，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)智能化采集、動(dòng)態(tài)監(jiān)控以及報(bào)警，綜合性控制。在設(shè)計(jì)中重點(diǎn)就是通過(guò)PLC/DCS/SCADA系統(tǒng)集成化管理，保障其符合GAMP5的計(jì)算機(jī)化系統(tǒng)驗(yàn)證，其中關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）利用在線/近線監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)控制，充分分析pH、DO、溫度、壓力、電導(dǎo)、UV、濁度等基礎(chǔ)信息參數(shù)，利用自動(dòng)化批次實(shí)現(xiàn)綜合控制。
2.5 可擴(kuò)展性與模塊化
工藝與設(shè)備在應(yīng)用中必須要根據(jù)實(shí)際狀況進(jìn)行平滑放大或者轉(zhuǎn)移處理，其中模塊化設(shè)計(jì)可以有效滿足生產(chǎn)需求，實(shí)現(xiàn)智能化調(diào)控。在設(shè)計(jì)中可以基于恒定kLa、P/V、混合時(shí)間、切向流速/膜面積比等相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行優(yōu)化處理，根據(jù)實(shí)際狀況進(jìn)行調(diào)控，利用工程化的方式進(jìn)行模塊化預(yù)制，便于實(shí)施。
Part.03關(guān)鍵技術(shù)分類與核心原理
3.1 離心分離
主要就是利用密度梯度差異達(dá)到分離細(xì)胞碎片、胞內(nèi)產(chǎn)物以及相關(guān)雜質(zhì)的目的。在應(yīng)用中其主要就是應(yīng)用連續(xù)流離心機(jī)控制轉(zhuǎn)速3000-10000×g以及進(jìn)料流速進(jìn)行處理，這樣則可以有效避免剪切力損傷產(chǎn)物。此原理主要就是在疫苗生產(chǎn)中的細(xì)胞收獲、血液制品澄清中應(yīng)用。
3.2 深層過(guò)濾
利用孔徑為1-10 μm進(jìn)行截留，可以達(dá)到吸附以及去除微小顆粒的目的。在應(yīng)用中要根據(jù)實(shí)際狀況優(yōu)化濾材組合，通過(guò)粗濾、精濾的方式進(jìn)行處理，可以有效提高載量50%。同時(shí)，在操作中要重點(diǎn)控制壓差，保障其 <2 bar，這樣則可以有效避免防濾膜破裂等問(wèn)題的出現(xiàn)，此種技術(shù)主要用于單抗收獲液澄清等相關(guān)操作。
3.3 層析技術(shù)
利用親和層析，如Protein A等方式進(jìn)行處理。主要是利用生物特異性結(jié)合抗體Fc段，這樣則可以一步捕獲純度>95%。在處理中要中重點(diǎn)做好風(fēng)險(xiǎn)控制，應(yīng)用 pH 3.0-3.5的低pH洗脫操作中，必須要對(duì)其快速中和，方可有效避免抗體聚集等問(wèn)題的出現(xiàn)。其中離子交換層析（IEX）主要就是基于電荷差異精純，達(dá)到消除宿主蛋白 ，使其<50 ppm。梯度優(yōu)化處理的重點(diǎn)就是通過(guò)階梯洗脫電導(dǎo)率5-50mS/cm，這樣則可以平衡分辨率以及收率。而疏水層析在高鹽條件下要綜合疏水殘基進(jìn)行處理，則可以處理聚集體。在應(yīng)用中要保障其鹽濃度小于產(chǎn)物沉淀的臨界點(diǎn)。
3.4. 膜分離技術(shù)
利用超濾/透析（TFF）技術(shù)進(jìn)行處理，主要就是通過(guò)分子量截留達(dá)到緩沖液置換以及濃縮處理，其參數(shù)控制的重點(diǎn)就是保障跨膜壓（TMP）<30 psi，其中切向流速>1 m/s，這樣則可以有效避免濃差極化的問(wèn)題出現(xiàn)。病毒過(guò)濾主要就是通過(guò)20 nm納濾膜強(qiáng)制清除病毒，LRV≥4； 在操作中要重點(diǎn)論證其對(duì)≤20 nm病毒的截留能力。
Part.04生物制藥設(shè)備和分離純化技術(shù)要點(diǎn)
生物制藥設(shè)備和分離純化技術(shù)通過(guò)三步式純化框架進(jìn)行處理。其中，捕獲階段的重點(diǎn)保障親和層析載量>30 g/L，縮短周期60%；精純?yōu)镮EX/HIC組合清除HCP、DNA；拋光主要就是通過(guò)分子篩（SEC）去除聚集體至<3%。 在應(yīng)用中其主要技術(shù)如表1所示。
表1.生物制藥設(shè)備和分離純化技術(shù)要點(diǎn)
4.1 離心階段
在應(yīng)用中聯(lián)合離心-深層過(guò)濾技術(shù)手段，操作中首先要先離心（3000×g）繼而去除大顆粒，處理之后再次過(guò)濾除微渣，可以有效提高澄清50%的效率。離心階段主要應(yīng)用碟片式離心機(jī)進(jìn)行處理，其可以在在3000×g離心力下分離細(xì)胞碎片（>5 μm）及大顆粒雜質(zhì)；在處理中要保障進(jìn)料流速≤50 L/h，規(guī)避剪切力對(duì)抗體片段等產(chǎn)物產(chǎn)生影響而出現(xiàn)斷裂等問(wèn)題。應(yīng)當(dāng)連續(xù)流層析（MCCS）技術(shù)進(jìn)行處理，在操作中主要就是通過(guò)Protein A捕獲串聯(lián)陰離子達(dá)到交換的目的，通過(guò)此種方式可以有效減少中間儲(chǔ)存，提高40%的產(chǎn)能。
4.2 深層過(guò)濾階段
串聯(lián)多級(jí)濾材，其中預(yù)過(guò)濾層主要包括了玻璃限位，其可以截留1-10 μm顆粒；而精濾層則主要就是利用纖維素/聚醚砜膜等材質(zhì)，其可以截留0.22的μm微粒。在應(yīng)用中可以根據(jù)實(shí)際狀態(tài)適宜應(yīng)用一定硅藻土助濾劑，這樣則可以達(dá)到吸附微顆粒的目的。通過(guò)多模式層析進(jìn)行優(yōu)化，利用混合例子交換+疏水作用的聯(lián)合應(yīng)用，可以有效提高綜合性能。
4.3 連續(xù)流層析（MCCS）
捕獲-精純串聯(lián)主要是通過(guò)Protein A柱為動(dòng)態(tài)載量>40 g/L，主要應(yīng)用pH 3.5洗脫抗體；在線中和操作的重點(diǎn)就是在洗脫液之后立即注入中和模塊，其中添加1 M Tris-HCl，pH 7.0，這樣則可以有效預(yù)防聚集等問(wèn)題的出現(xiàn)。陰離子交換柱要綜合流穿模式，可以清除HCP、DNA。連續(xù)運(yùn)行機(jī)制主要就是通過(guò)三柱循環(huán)，趨勢(shì)當(dāng)1號(hào)柱上樣時(shí)，2號(hào)柱洗脫，3號(hào)柱再生；而在閥門切換時(shí)序主要為每15分鐘輪轉(zhuǎn)，重點(diǎn)做好規(guī)范化管理，方可有效保障進(jìn)料的連續(xù)性。
4.4 多模式層析
其主要配基結(jié)構(gòu)為季銨基團(tuán)+ 苯基，具有離子交換以及疏水作用的作用。在應(yīng)用中低鹽條件下，季銨基團(tuán)結(jié)合帶負(fù)電蛋白；而在高鹽條件下，苯基結(jié)合疏水雜質(zhì)，例如聚集體等。
在操作中，其上樣主要為料液電導(dǎo)率20mS/cm，這樣則可以有效促進(jìn)疏水結(jié)合。而其洗脫主要就是根據(jù)實(shí)際狀況，通過(guò)階梯增加鹽濃度的方式進(jìn)行處理。如0→1 M NaCl + pH梯度。梯度為7.0→5.0，通過(guò)此種方式進(jìn)行優(yōu)化，可以同步洗脫不同雜質(zhì)。
Part.05生物制藥設(shè)備和分離純化技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)控制
5.1 產(chǎn)物穩(wěn)定性
保障在處理之后，通過(guò)層析洗脫后立即中和。例如，將pH 3.5中和為7.0，其時(shí)間<5 min，通通過(guò)此種方式進(jìn)行處理，可以有效避免抗體變性等問(wèn)題的出現(xiàn)。超濾過(guò)程添加 0.1 M精氨酸等相關(guān)穩(wěn)定劑，則可以達(dá)到抑制聚集的目的。
5.2 雜質(zhì)清除驗(yàn)證
重點(diǎn)處理宿主蛋白（HCP），通過(guò)ELISA檢測(cè)限<1 ng/mL，其中目標(biāo)殘留<100 ng/mg則符合要求。 DNA殘留主要就是保障qPCR定量<10ng/劑量；內(nèi)毒素利用鱟試劑檢測(cè)<0.1 EU/mg。
5.3 設(shè)備相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)
- 層析柱必須要保障裝柱均一性測(cè)試，其中HETP≤2倍粒徑，方可有效避免溝流等問(wèn)題的出現(xiàn)。過(guò)濾器要根據(jù)要求進(jìn)行完整性測(cè)試，保障其起泡點(diǎn)≥3.5 bar，確保無(wú)菌方可應(yīng)用。離心機(jī)主要就是通過(guò) 密閉設(shè)計(jì)+SIP在線滅菌，這樣則可以有效預(yù)防生物污染。
Part.06結(jié) 論
綜上所述，生物制藥設(shè)備和分離純化技術(shù)的研究是一個(gè)持續(xù)優(yōu)化和創(chuàng)新的領(lǐng)域。其重點(diǎn)要充分分析產(chǎn)品與雜質(zhì)，根據(jù)實(shí)際狀況匹配技術(shù)與目標(biāo)，應(yīng)用自動(dòng)化程度高的設(shè)備工藝，通過(guò)科學(xué)的方式優(yōu)化工藝參數(shù)，方可達(dá)到控制成本與效率的目的。而重點(diǎn)做好設(shè)備與分離純化技術(shù)要點(diǎn)的深入研究，是實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量、安全、有效且具有成本競(jìng)爭(zhēng)力的生物藥商業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵保障。
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