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實(shí)驗(yàn)室常用的色譜是如何定量？依據(jù)和方法有什么?今天小析姐就和大家討論一下色譜的定量依據(jù)和定量方法。

色譜定量依據(jù)

以氣相色譜為例，氣相色譜是用峰面積或者峰高來定量的。依據(jù)如下：

1、最重要的第一條，就是檢測(cè)器的線性響應(yīng)關(guān)系。

在所有的色譜檢測(cè)器中，除了FPD之外，所有的檢測(cè)器都遵從線性響應(yīng)，也就是說m=KS。這里m指單位時(shí)間內(nèi)到達(dá)檢測(cè)器的待測(cè)物質(zhì)的量（包括質(zhì)量或物質(zhì)的量），K表示線性響應(yīng)系數(shù)，S表示檢測(cè)器響應(yīng)信號(hào)的值。也就是說，檢測(cè)器響應(yīng)信號(hào)的大小與單位時(shí)間到達(dá)檢測(cè)器的被測(cè)物質(zhì)的總量成正比。當(dāng)然我們也知道，這個(gè)關(guān)系是有范圍的，量太大或者太小，都會(huì)脫離線性。

2、其次就是第二條，就是塔板理論。

塔板理論充分闡述了峰高與進(jìn)樣量之間的關(guān)系，或者說他們之間是成正比的。這個(gè)可以參考對(duì)塔板理論的說明。

根據(jù)這兩條，可以肯定的說待測(cè)物質(zhì)的峰高與待測(cè)物的進(jìn)樣總量成正比。或者利用微積分可以推斷出待測(cè)物質(zhì)的峰面積和待測(cè)物的進(jìn)樣總量成正比。既然峰高和峰面積都與進(jìn)樣總量成正比，為什么我們喜歡用峰面積，而不是更簡(jiǎn)單的峰高呢？這個(gè)問題也很簡(jiǎn)單，因?yàn)樗謇碚摬煌耆_，峰形經(jīng)常不完全滿足正態(tài)分布，所以峰高的代表性不足。

什么時(shí)候峰高能夠有良好的代表性？很明顯，峰形良好而且對(duì)稱，成良好的正態(tài)分布曲線形狀的時(shí)候，或者說峰形尖銳且對(duì)稱的時(shí)候。

色譜峰經(jīng)常拖尾，所以用峰面積定量就可以了，峰面積絕大多數(shù)情形下都具有很好的代表性。但是在檢測(cè)器超載，或模數(shù)轉(zhuǎn)換器超載，或峰面積積分不準(zhǔn)，或進(jìn)樣代表性不足，以及一些其他特殊情形下，用峰面積也不能得到正確結(jié)果。但無論如何，用峰面積定量已經(jīng)是我們可實(shí)行的最準(zhǔn)確方法了。

色譜定量方法

色譜定量方法共四種：外標(biāo)法、歸一化法、內(nèi)標(biāo)法、內(nèi)加法（標(biāo)準(zhǔn)加入法）。

再細(xì)分歸一化法還可以分為百分比法，帶校正因子的歸一化法，部分歸一化法等。在這些定量方法中，百分比法和外標(biāo)法最簡(jiǎn)單，內(nèi)加法最麻煩。下面講解這些方法各自適合的情況。

1、歸一化法

把所有出峰的組分含量之和按100%計(jì)的定量方法，稱為歸一化法。

各成分校正因子一致時(shí)可用該法，該法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，特別是進(jìn)樣量不容易準(zhǔn)確控制時(shí)，進(jìn)樣濃度及進(jìn)樣量的變化的影響很小。

其他操作條件，如流速、柱溫等變化對(duì)定量結(jié)果的影響也很小，GC廣泛應(yīng)用于HPLC。

2、外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法、直接比較法）

首先用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

具體作法是：用標(biāo)準(zhǔn)樣品配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列，在與欲測(cè)組分相同的色譜條件下，等體積準(zhǔn)確量進(jìn)樣，測(cè)量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對(duì)樣品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線應(yīng)是通過原點(diǎn)的直線。若標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過原點(diǎn)，說明測(cè)定方法存在系統(tǒng)誤差。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率即為絕對(duì)校正因子。

當(dāng)欲測(cè)組分含量變化不大，并已知這一組分的大概含量時(shí)，也可以不必繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，而用單點(diǎn)校正法，即直接比較法定量。單點(diǎn)校正法實(shí)際上是利用原點(diǎn)作為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上的另一個(gè)點(diǎn)。因此，當(dāng)方法存在系統(tǒng)誤差時(shí)（即標(biāo)準(zhǔn)工作曲線不通過原點(diǎn)），單點(diǎn)校正法的誤差較大。因此規(guī)定，y=ax+b，b的絕對(duì)值應(yīng)不大于100%響應(yīng)值是y的2%。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點(diǎn)：繪制好標(biāo)準(zhǔn)工作曲線后測(cè)定工作就很簡(jiǎn)單了，計(jì)算時(shí)可直接從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上讀出含量，這對(duì)大量樣品分析十分合適。特別是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制后可以使用一段時(shí)間，在此段時(shí)間內(nèi)可經(jīng)常用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行單點(diǎn)校正，以確定該標(biāo)準(zhǔn)工作曲線是否還可使用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線法的缺點(diǎn)：每次樣品分析的色譜條件（檢測(cè)器的響應(yīng)性能，柱溫度，流動(dòng)相流速及組成，進(jìn)樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差。另外，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制時(shí)，一般使用欲測(cè)組分的標(biāo)準(zhǔn)樣品（或已知準(zhǔn)確含量的樣品），因此對(duì)樣品前處理過程中欲測(cè)組分的變化無法進(jìn)行補(bǔ)償。

3、內(nèi)標(biāo)法

選擇適宜的物質(zhì)作為欲測(cè)組分的參比物，定量加到樣品中去，依據(jù)欲測(cè)組分和參比物在檢測(cè)器上的響應(yīng)值（峰面積或峰高）之比和參比物加入的量進(jìn)行定量分析的方法稱為內(nèi)標(biāo)法。

內(nèi)標(biāo)法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是原樣品中不存在的純物質(zhì)，該物質(zhì)的性質(zhì)應(yīng)盡可能與欲測(cè)組分相近，不與被測(cè)樣品起化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)要能完全溶于被測(cè)樣品中。內(nèi)標(biāo)物的峰應(yīng)盡可能接近欲測(cè)組分的峰，或位于幾個(gè)欲測(cè)組分的峰中間，但必須與樣品中的所有峰不重疊，即完全分開。

內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣量的變化，色譜條件的微小變化對(duì)內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果的影響不大，特別是在樣品前處理（如濃縮、萃取，衍生化等）前加入內(nèi)標(biāo)物，然后再進(jìn)行前處理時(shí)，可部分補(bǔ)償欲測(cè)組分在樣品前處理時(shí)的損失。若要獲得很高精度的結(jié)果時(shí)，可以加入數(shù)種內(nèi)標(biāo)物，以提高定量分析的精度。

內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)：選擇合適的內(nèi)標(biāo)物比較困難，內(nèi)標(biāo)物的稱量要準(zhǔn)確，操作較麻煩。使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)要測(cè)量欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的兩個(gè)峰的峰面積（或峰高），根據(jù)誤差疊加原理，內(nèi)標(biāo)法定量的誤差中，由于峰面積測(cè)量引起的誤差是由于進(jìn)樣量的變化和色譜條件變化引起的誤差，內(nèi)標(biāo)法比標(biāo)準(zhǔn)曲線法要小很多，所以總的來說，內(nèi)標(biāo)法定量比標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的準(zhǔn)確度和精密度都要好。

4、標(biāo)準(zhǔn)加入法

標(biāo)準(zhǔn)加入法實(shí)質(zhì)上是一種特殊的內(nèi)標(biāo)法，是在選擇不到合適的內(nèi)標(biāo)物時(shí)，以欲測(cè)組分的純物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)物，加入到待測(cè)樣品中，然后在相同的色譜條件下，測(cè)定加入欲測(cè)組分純物質(zhì)前后欲測(cè)組分的峰面積（或峰高），從而計(jì)算欲測(cè)組分在樣品中的含量的方法。

標(biāo)準(zhǔn)加入法的優(yōu)點(diǎn)：不需要另外的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，只需欲測(cè)組分的純物質(zhì)，進(jìn)樣量不必十分準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單。若在樣品的前處理之前就加入已知準(zhǔn)確量的欲測(cè)組分，則可以完全補(bǔ)償欲測(cè)組分在前處理過程中的損失，是色譜分析中較常用的定量分析方法。

標(biāo)準(zhǔn)加入法的缺點(diǎn)：要求加入欲測(cè)組分前后兩次色譜測(cè)定的色譜條件完全相同，以保證兩次測(cè)定時(shí)的校正因子完全相等，否則將引起分析測(cè)定的誤差。

簡(jiǎn)單來說，當(dāng)我們能精確進(jìn)樣的時(shí)候，也就是能夠保證每一次進(jìn)樣總的進(jìn)樣體積都一樣的時(shí)候，我們總是傾向于選擇外標(biāo)法，當(dāng)然有些時(shí)候也選擇歸一化法。當(dāng)我們無法精確進(jìn)樣的時(shí)候，我們總是傾向于歸一化法。當(dāng)我們無法精確進(jìn)樣，又無法使用歸一化法的時(shí)候，我們總是傾向于選擇內(nèi)標(biāo)法。當(dāng)我們用內(nèi)標(biāo)法也無法解決的時(shí)候，我們會(huì)選用內(nèi)加法或者標(biāo)準(zhǔn)加入法這個(gè)復(fù)雜的方式來定量。