1 實(shí)驗(yàn)原理
雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)（Dual Luciferase Reporter Assay System）是一種常用于評估基因調(diào)控元件（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或microRNA靶點(diǎn)）活性的實(shí)驗(yàn)方法。該系統(tǒng)通常涉及兩個(gè)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，其目的是為了提供更準(zhǔn)確和可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。這兩個(gè)質(zhì)粒及其作用如下：
1. 報(bào)告質(zhì)粒（Reporter Vector）：
這個(gè)質(zhì)粒包含了待研究的調(diào)控序列上游的螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase, Fluc）基因。這個(gè)調(diào)控序列可以是啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或其他順式作用元件。
當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后，如果調(diào)控序列活躍，則會(huì)驅(qū)動(dòng)螢火蟲熒光素酶基因的表達(dá)。通過測量螢火蟲熒光素酶的活性，我們可以間接了解目標(biāo)調(diào)控序列的功能或活性水平。
2. 內(nèi)參質(zhì)粒（Control Vector）：
內(nèi)參質(zhì)粒通常攜帶海腎熒光素酶（Renilla luciferase, Rluc）基因，作為內(nèi)部對照使用。它不受實(shí)驗(yàn)處理的影響，并且在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中保持恒定表達(dá)。
海腎熒光素酶的作用是標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以校正由于細(xì)胞數(shù)量差異、轉(zhuǎn)染效率變化或其它實(shí)驗(yàn)條件波動(dòng)帶來的影響。通過比較兩種熒光素酶的相對活性，可以獲得更加可靠的數(shù)據(jù)。
通過同時(shí)轉(zhuǎn)染這兩個(gè)質(zhì)粒并檢測兩種不同類型的熒光素酶活性，研究人員可以得到關(guān)于特定調(diào)控序列功能的信息，同時(shí)確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。這種方法廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究中，尤其是在探索基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制時(shí)。
2 實(shí)驗(yàn)流程
3 實(shí)驗(yàn)步驟
1、報(bào)告基因質(zhì)粒構(gòu)建：將目的片段插入到熒光素酶表達(dá)的報(bào)告基因載體上，如pGL3-basic、Psicheck-2等常見載體。通常是把目的基因結(jié)合區(qū)域或者基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上游，構(gòu)建成熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。
2、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：選擇合適的細(xì)胞系，如常用的工具細(xì)胞HEK293T等，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37°C、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%~80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
3、共轉(zhuǎn)染：將構(gòu)建好的報(bào)告基因質(zhì)粒和帶有海腎熒光素酶基因的內(nèi)參質(zhì)粒，按照一定比例使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等方法共同轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。
以miRNA靶基因驗(yàn)證為例 ：
4、細(xì)胞裂解：轉(zhuǎn)染后48h左右，去除培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞1~2次，加入細(xì)胞裂解液，室溫裂解細(xì)胞15~30min左右，以保證細(xì)胞充分裂解。
5、熒光素酶活性測定：初次使用時(shí)，需配制Firefly Luciferase（螢火蟲熒光素酶）的底物，將其溶解在LARII buffer（Buffer 1）中，并分裝-80℃避光保存；同時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配Stop & Glo（Buffer 2），即Renilla Luciferase（海參熒光素酶）的底物，用于終止LARII buffer（Buffer 1）的反應(yīng)。
6、檢測讀數(shù)：向一定量（如40μl）的LARII中加入適量（如10μl）細(xì)胞裂解液，吹打混勻后，立即用酶標(biāo)儀檢測讀數(shù)，即為Firefly luciferase的值；接著加入等量的Stop & Glo，再次讀數(shù)，即為Renilla Luciferase的值。
7、數(shù)據(jù)處理與分析：計(jì)算每管的Firefly Luciferase/Renilla Luciferase的比值，再以control組的比值為單位，得到不同處理組的相對luciferase活性，以此來反映該處理組基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控活性。通常采用t檢驗(yàn)或方差分析等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較各樣品間相對熒光值的差異，判斷目的基因?qū)晒馑孛富钚缘挠绊懯欠耧@著。
8、結(jié)果分析和解讀：
（1）相對熒光素酶活性（Relative Luciferase Activity，RLA）的計(jì)算方法，即RLA=螢火蟲熒光素酶活性值（Fluc值）/海腎熒光素酶活性值（Rluc值）。以miRNA靶基因驗(yàn)證為例 ：計(jì)算步驟步驟如下：
1.先計(jì)算出每孔的Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase的比值(F/R);
2.求出miRNA-Ctrl三個(gè)重復(fù)孔的平均值(average1)
3.再以miRNA-Ctrl組的average1為標(biāo)準(zhǔn)1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即用miRNA mimic組的F/R三個(gè)重復(fù)值分別除以相對應(yīng)組別average1得到三個(gè)比值
4.上一步中求出的比值的平均值作為average2，并分別用average1和average2的值作柱狀圖
表1 歸一化數(shù)據(jù)處理
（2）以對照組為參照分析相對活性變化
1）雙熒光素酶活性升高：若實(shí)驗(yàn)組的RLA值顯著高于對照組，例如對照組RLA為1，實(shí)驗(yàn)組RLA為3，通常提示所研究的調(diào)控元件對報(bào)告基因（螢火蟲熒光素酶）的轉(zhuǎn)錄具有激活作用，即可能促進(jìn)了目標(biāo)基因的表達(dá)啟動(dòng)或增強(qiáng)了表達(dá)水平。
2）雙熒光素酶活性降低：當(dāng)實(shí)驗(yàn)組的RLA值明顯低于對照組時(shí)，比如對照組RLA為1，實(shí)驗(yàn)組RLA為0.5，則表明該調(diào)控元件可能抑制了報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，使目標(biāo)基因表達(dá)量相對減少。
3）無顯著差異：若實(shí)驗(yàn)組與對照組的RLA值相近，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不存在顯著差異，說明在所設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下，該調(diào)控元件對目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄可能沒有明顯的調(diào)控作用。
4 注意事項(xiàng)
1、試劑準(zhǔn)備與保存：螢火蟲熒光素酶底物L(fēng)ARII需按需分裝，-80℃避光保存，避免反復(fù)凍融；海腎熒光素酶底物Stop&Glo需現(xiàn)配現(xiàn)用。配好的LARII在-20℃可穩(wěn)定一個(gè)月，在-70℃可穩(wěn)定一年。
2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：注意轉(zhuǎn)染試劑的質(zhì)量和使用說明，不同細(xì)胞系對轉(zhuǎn)染試劑的敏感性可能不同，可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如轉(zhuǎn)染試劑的用量、細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染時(shí)間等。
3、設(shè)立陽性和陰性對照，以確保轉(zhuǎn)染的成功和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。例如，可設(shè)置轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照和已知有相互作用的陽性對照組合。
4、實(shí)驗(yàn)操作過程：整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程要注意避光，尤其是在試劑配制、細(xì)胞裂解后以及熒光檢測過程中，防止熒光素酶底物見光分解影響檢測結(jié)果。
5、實(shí)驗(yàn)操作盡量在短時(shí)間內(nèi)完成，一般建議在30min內(nèi)，以減少細(xì)胞裂解產(chǎn)物等在室溫下放置時(shí)間過長可能導(dǎo)致的活性變化。
6、樣品和測定試劑混合后到測定前的時(shí)間應(yīng)盡量控制在相同時(shí)間內(nèi)，通常1~2s，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。
7、結(jié)果分析與問題排查：如果測量的熒光值較低，首先排除轉(zhuǎn)染效率問題，可通過在12孔板多鋪一孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光質(zhì)粒，觀察轉(zhuǎn)染的熒光效率；若排除轉(zhuǎn)染問題后熒光讀值仍然較低，可以嘗試增加轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量。
8、若測量的熒光值過高，則可減少轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量，或者適當(dāng)稀釋細(xì)胞裂解離心后的上清液。
9、若背景過高可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，需檢查試劑是否被污染、細(xì)胞是否有自發(fā)熒光等問題，并采取相應(yīng)的解決措施。
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