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摘 要： 建立高效液相色譜法測定鹽酸萘甲唑啉滴鼻液中的有關物質。色譜柱采用LiChrospher 60 RP-select B柱（250 mm ×4 mm，5 μm），流動相為乙腈-水-冰乙酸（體積比為320∶680∶5，含體積分數(shù)0.11%的辛烷磺酸鈉），流量為1 mL/min；進樣體積為20 μL；柱溫為25 ℃；檢測波長為280 nm。在測定條件下，鹽酸萘甲唑啉及有關物質A、B、C、D在質量濃度分別為0.026～12.480、0.050～98.787、0.049～12.012、0.049～12.067，0.051～12.012 μg/mL時與各自色譜峰面積呈良好線性關系；各有關物質測定平均回收率為96.7%～99.6%，測定結果的相對標準偏差為0.23%～0.28% （n=6）。該方法專屬性強、準確度與精密度較好，可用于鹽酸萘甲唑啉滴鼻液有關物質的測定。

 

關鍵詞： 色譜分析； 有關物質； 高效液相色譜法； 鹽酸萘甲唑啉滴鼻液； 方法學驗證

 

鹽酸萘甲唑啉屬于腎上腺素能受體交感激動劑，化學名為4，5-二氫-2-(1-萘甲基)-1H-咪唑鹽酸鹽，廣泛應用于眼和鼻黏膜的減充血劑，具有收縮血管的作用，有助于緩解鼻腔組織的水腫[1?2]。含有鹽酸萘甲唑啉化合物的滴劑常被用來做滴鼻液或滴眼液，臨床上用于治療過敏性鼻充血、炎癥性鼻充血、急慢性鼻炎[3]。目前合成鹽酸萘甲唑啉的方法按照起始物料分類主要分為兩種，一是1-萘乙酸與乙二胺發(fā)生反應生成鹽酸萘甲唑啉[4?5]，二是1-萘乙腈與乙二胺發(fā)生反應得到目標化合物[6?8]。對于鹽酸萘甲唑啉原料藥，歐洲藥典明確規(guī)定了4種有關雜質結構(如圖１所示)。雜質A是工藝雜質或降解雜質，可能由咪唑結構中的亞胺鍵不穩(wěn)定開環(huán)導致；雜質B由雜質A降解產(chǎn)生；雜質C由1-萘乙腈和乙二胺發(fā)生反應時，未反應的殘留的起始物料；雜質D由1-萘乙腈位置異構化衍生而來。

圖1   雜質結構

Fig. 1   Impurity structure

 

對于鹽酸萘甲唑啉滴鼻液有關物質的檢測方法，中華人民共和國藥典以及國外藥典中尚未收錄[9?11]，且相關文獻較少。筆者參考現(xiàn)有的檢測方法[12?14]，建立了高效液相色譜(HPLC)法測定鹽酸萘甲唑啉滴鼻液中的有關物質，為鹽酸萘甲唑啉滴鼻液有關物質的測定提供檢測方法。

 

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-2050C 3D型，日本京都株式會社島津制造所。

電子分析天平：AUW220型，感量為0.01 mg，日本京都株式會社島津制作所。

pH計：PHS-3E型，上海儀電科學儀器股份有限公司。

鹽酸萘甲唑啉滴鼻液：批號分別為C180230101、C180230102、C180230103，石家莊格瑞藥業(yè)有限公司。

鹽酸萘甲唑啉工作對照品：批號為G20220727，石家莊格瑞藥業(yè)有限公司。

雜質A、B、C、D標準品：批號分別為0512-RD-0051、0225-RA-0015、0225-RA-0016、22126-67-6，廣州佳途科技股份有限公司。

乙腈：色譜純，安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司。

冰乙酸：分析純，天津歐博凱化工有限公司。

辛烷磺酸鈉：分析純，天津科密歐化學試劑有限公司。

實驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：LiChrospher 60 RP-select B柱(250 mm×4 mm，5 μm，德國默克公司)，流動相：乙腈-水-冰乙酸(體積比為320∶680∶5，含體積分數(shù)0.11%的辛烷磺酸鈉)；洗脫方式：等度洗脫；流量：1 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm；進樣體積：20 μL。

1.3 溶液配制

空白溶劑（流動相）：乙腈-水-冰乙酸(體積比為320∶680∶5，含體積分數(shù)0.11%的辛烷磺酸鈉)。

雜質A、B、C、D對照品儲備液：分別精密稱取雜質A、B、C、D對照品10 mg，置于4只20 mL容量瓶中，用空白溶劑溶解并定容至標線，搖勻，制得雜質A、雜質B、雜質C、雜質D質量濃度均為0.5 mg/mL的4種對照品儲備液。

系統(tǒng)適用性溶液：精密稱取鹽酸萘甲唑啉工作對照品5 mg，置于10 mL容量瓶中，加入雜質A、B、C、D對照品儲備液各1 mL，用空白溶劑溶解并定容至標線，搖勻，制得鹽酸萘甲唑啉、雜質A、雜質B、雜質C、雜質D質量濃度分別為0.5 mg/mL、50 μg/mL、50 μg/mL、50 μg/mL、50 μg/mL的系統(tǒng)適用性溶液。

鹽酸萘甲唑啉對照品儲備液：500 μg/mL。精密稱取鹽酸萘甲唑啉工作對照品10 mg，置于20 mL容量瓶中，用空白溶劑溶解并定容至標線，搖勻。

鹽酸萘甲唑啉對照品溶液：60 μg/mL。精密移取3 mL鹽酸萘甲唑啉對照品儲備液于25 mL容量瓶中，用空白溶劑定容至標線，搖勻。

雜質A對照品溶液：精密移取鹽酸萘甲唑啉對照品溶液及雜質A對照品儲備液各1 mL于同一10 mL容量瓶中，用空白溶劑定容至標線，搖勻，制得雜質A、鹽酸萘甲唑啉質量濃度分別為50、6 μg/mL的雜質A對照品溶液。

雜質B、C、D混合對照品溶液：精密移取雜質B、C、D對照品儲備液各3 mL于同一25 mL容量瓶中，用空白溶劑定容至標線，搖勻，制得各組分質量濃度均為60 μg/mL的雜質B、C、D混合對照品溶液。

樣品溶液：0.5 mg/mL。精密移取鹽酸萘甲唑啉滴鼻液10 mL于20 mL容量瓶中，用空白溶劑定容至標線，搖勻。

1.4 實驗方法

取樣品溶液，雜質A對照品溶液，雜質B、C、D對照品溶液，在1.2條件下進樣分析，記錄色譜峰面積，雜質A按照外標法進行計算，其他雜質按照加校正因子的主成分外標法計算雜質含量。

 

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)相關資料及主藥的性質考察了不同色譜柱，采用Inertsil ODS-3色譜柱時，鹽酸萘甲唑啉和雜質A之間的分離度不符合要求，不能完全分離；采用辛基硅烷鍵合硅膠柱獲得的色譜圖分離度較好[10]，對主成分及雜質均能良好分離，且LiChrospher 60 RP-select B柱獲得的峰形最佳，而且對流動相的要求較低，故選用此色譜柱。

2.2 檢測波長的選擇

將鹽酸萘甲唑啉對照品儲備液，雜質A、B、C、D對照品儲備液分別在波長190～400 nm下采用紫外分光光度計進行全波長掃描，結果見表1。由表1可見，萘甲唑啉、雜質A、雜質B、雜質C、雜質D均在280、220 nm附近有最大響應值[15]，但在280 nm波長檢測時基線噪聲小，不影響目標物檢測，因此，選擇檢測波長為280 nm。

表1   最大吸收波長

Tab. 1   Maximum absorption wavelength

 

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取空白溶液、系統(tǒng)適用性溶液各20 μL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖如圖2、圖3，測定結果見表2。結果表明，雜質A、鹽酸萘甲唑啉、雜質D、雜質B、雜質C順序出峰，相鄰峰之間的分離度大于2.0，均能有效分離。

圖2   空白溶液色譜圖

Fig. 2   Chromatogram of blank solution

圖3   系統(tǒng)適用性色譜圖

Fig. 3   Chromatogram of system suitability

1—雜質A； 2—鹽酸萘甲唑啉； 3—雜質D； 4—雜質B； 5—雜質C

表2   系統(tǒng)適用性結果

Tab.2   Results of system suitability

 

將空白溶劑、空白輔料以及樣品溶液各分別取20 μL進樣，并對所形成的色譜圖進行記錄。結果見表2。由表2可知，各組分均不干擾主峰和雜質的出峰檢測，專屬性良好。

2.4 降解試驗

酸破壞：精密量取鹽酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mol/L鹽酸溶液，放置4 h后，加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中和，然后加入空白溶劑稀釋至標線，搖勻，作為酸破壞溶液。

堿破壞：精密量取鹽酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，放置4 h后，加入0.5 mol/L鹽酸溶液使其中和，然后加入空白溶劑稀釋至標線，搖勻，作為堿破壞溶液。

高溫破壞：精密量取鹽酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL于10 mL容量瓶中，80 ℃下放置4 h，冷卻后加空白溶劑溶解并稀釋至標線，搖勻，作為高溫破壞溶液。

光照破壞：精密量取鹽酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL于10 mL容量瓶中，放入光照穩(wěn)定箱下照射24 h后取出，加空白溶劑溶解并稀釋至標線，搖勻，作為光照破壞溶液。

氧化破壞：精密量取鹽酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL于10 mL容量瓶中，加入體積分數(shù)為30%的雙氧水溶液使其溶解，室溫放置24 h后，加空白溶劑稀釋至標線，搖勻，作為氧化破壞溶液。

分別量取上述5種溶液20 μL，注入HPLC儀，記錄色譜圖，如圖4。

圖4   降解試驗色譜圖

Fig. 4   Chromatographic diagram of degradation test

試驗結果表明，鹽酸萘甲唑啉滴鼻液在強酸、強堿、高溫、光照、氧化條件下均有不同程度降解，鹽酸萘甲唑啉滴鼻液在堿破壞和高溫條件下降解程度較大，但各降解雜質可以與主峰有良好的分離。

2.5 線性關系與檢出限、定量限

分別精密移取鹽酸萘甲唑啉對照品儲備液0.1 mL、各雜質對照品儲備液0.2 mL于同一20 mL容量瓶中，定容至標線，搖勻，再精密移取上述溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，定容至標線，搖勻，作為線性1溶液；分別精密移取雜質A對照品溶液，雜質B、C、D混合對照品溶液各1、2、3、4 mL于4只20 mL容量瓶中，用空白溶劑稀釋至標線，搖勻，作為線性2、3、4、5溶液。按1.2色譜條件依次進樣測定，以各組分的質量濃度為橫坐標，以對應色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關系數(shù)。取線性1溶液適量，用空白溶劑逐級稀釋后，按1.2色譜條件檢測，以信噪比3∶1時對應的樣品溶液中目標物的質量濃度作為檢出限，以信噪比10∶1時對應的樣品溶液中目標物的質量濃度作為定量限。

線性試驗溶液質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、校正因子及檢出限、定量限見表3。

表3   線性試驗溶液質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、校正因子及檢出限、定量限

Tab. 3   Linear test solution mass concentration linear range, linear equation, correlation coefficient, correction factor, detection limit, quantitative limit

 

2.6 樣品加標回收試驗

取鹽酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL，分別加入適量的雜質A對照品儲備液和雜質B、C、D混合對照品溶液，置于10 mL容量瓶中，用空白試劑定容至標線，搖勻，配制成高中低3種水平加標樣品溶液，每個加標水平平行配制3份。分別精密量取各加標樣品溶液20 μL進樣，記錄色譜峰面積，計算回收率，結果見表4。由表4可見，各組分加標回收率為96.7%～99.6%，說明該方法準確度良好。

表4   樣品加標回收試驗結果

Tab. 4   Test results of recovery rate

 

2.7 方法精密度

取批號為C180230101的鹽酸萘甲唑啉滴鼻液5 mL，加入雜質A對照品儲備液和雜質B、C、D對照品儲備液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，加空白溶劑稀釋至標線，搖勻，平行制備6份樣品，在1.2色譜條件下進樣分析，記錄色譜圖，檢測結果見表5。由表5可知，雜質各組分測定結果的相對標準偏差(RSD)為0.23%～0.28%，說明該方法精密度良好。

表5   精密度試驗結果

Tab. 5   Precision test results

 

2.8 耐用性

改變色譜條件中的柱溫(±2 ℃)、流量(±0.2 mL/min)、波長(±2 nm)，有機相比例乙腈-水-冰乙酸(300∶700∶5)～乙腈-水-冰乙酸(340∶660∶5)、不同色譜柱(同廠家不同柱號)，考察各條件下系統(tǒng)適用性溶液各色譜峰之間的分離度、樣品溶液中有關物質的變化情況，結果見表6。

表6   耐用性試驗結果

Tab. 6   Durability test results

 

由表6可知，樣品溶液中雜質的檢出個數(shù)相同、雜質檢出量與原條件比值符合要求(80%～120%)。因此色譜條件的微小變動對鹽酸萘甲唑啉滴鼻液中雜質測定結果無影響，表明該方法耐用性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取樣品溶液、雜質A對照品溶液，在4 ℃分別放置0 h、19 h、34 h、61 h，各分別取20 μL進樣，記錄色譜峰面積，結果見表7。

表7   穩(wěn)定性試驗結果

Tab. 7   Stability test results

 

由表7可知，樣品溶液在4 ℃放置約61 h，主峰面積相對于0 h的比值為99.71%，說明樣品溶液于4 ℃條件下放置61 h穩(wěn)定。對照品溶液在4 ℃放置約61 h，主峰面積相對于0 h的比值為102.33%，說明對照品溶液于4 ℃條件下放置61 h穩(wěn)定。

 

3 結論

針對《中華人民共和國藥典》(2020版)鹽酸萘甲唑啉有關物質檢測中薄層色譜法存在的定量分析局限性，創(chuàng)新性地建立了基于高效液相色譜的定量檢測方法。與傳統(tǒng)方法相比，該方法通過色譜條件的優(yōu)化，實現(xiàn)鹽酸萘甲唑啉主成分與4種潛在雜質的高效分離。經(jīng)系統(tǒng)方法學驗證，該方法各雜質定量分析的精密度、準確度良好，專屬性、耐用性強均顯著優(yōu)于ICH Q2 (R1)指導原則要求，特別在強制降解試驗中可以鑒別出經(jīng)不同破壞產(chǎn)生的新雜質，證明其卓越的專屬性。

該檢測體系的建立不僅填補了現(xiàn)行質量標準中雜質定量控制的空白，其“質量源于設計”的研究理念更推動了滴鼻液制劑從終產(chǎn)品檢測向生產(chǎn)過程質量監(jiān)控的轉變，對提升鼻用制劑質量可控性、保障臨床用藥安全具有重要示范意義，為同類品種分析方法升級提供了創(chuàng)新性技術路徑。

 

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