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摘 要： 建立了一種連續(xù)流動(dòng)分析-在線鎘柱還原法檢測(cè)肉及肉制品中亞硝酸鹽及硝酸鹽的含量。試樣經(jīng)處理沉淀蛋白質(zhì)并除去脂肪后，用流動(dòng)分析儀自動(dòng)進(jìn)樣且采用氣泡隔斷樣品，通過透析膜進(jìn)行透析除雜，亞硝酸鹽與磺胺重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合成紫紅色化合物，在538 nm處進(jìn)行測(cè)試，從而測(cè)得亞硝酸鹽的含量；硝酸鹽在鎘柱的還原下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，通過計(jì)算測(cè)得的亞硝酸鹽總量與試樣中原有亞硝酸鹽含量的差值，得到試樣中硝酸鹽的含量。亞硝酸鹽、硝酸鹽質(zhì)量濃度分別在0.025～1.0 mg/L、0.25～5.0 mg/L內(nèi)與測(cè)定信號(hào)值線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9、0.999 5，加標(biāo)回收率分別為93.0%～103.3%、95.8%～104.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.16%～7.55%、3.49%～6.02%（n=6），二者的準(zhǔn)確度和精密度均滿足技術(shù)要求。該方法高效、準(zhǔn)確、自動(dòng)化，為肉及肉制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的快速檢測(cè)提供了一種新的解決方案，具有顯著的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。

 

關(guān)鍵詞： 連續(xù)流動(dòng)分析； 肉及肉制品； 亞硝酸鹽； 硝酸鹽

 

肉及肉制品是人們?nèi)粘ｏ嬍成钪袛z取蛋白質(zhì)的主要來源，在肉及肉制品加工過程中會(huì)添加或者產(chǎn)生亞硝酸鹽及硝酸鹽，高劑量的亞硝酸鹽和硝酸鹽攝入會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用，這主要是因?yàn)檫M(jìn)入人體的硝酸鹽可轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽會(huì)轉(zhuǎn)化為亞硝胺，亞硝胺是一種強(qiáng)致癌物，如果長期或高劑量攝入這類化合物，會(huì)嚴(yán)重危害人體健康[1?2]。軒偉等[3]對(duì)2014～2018年市場上售賣的熟肉制品中亞硝酸鹽殘留量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)市場上不同場所銷售的熟肉制品都存在一定量的亞硝酸鹽及硝酸鹽，部分產(chǎn)品甚至存在含量超標(biāo)的問題。張雪茹等[4]研究發(fā)現(xiàn)，不同加工方式會(huì)對(duì)牛肉中的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量產(chǎn)生很大的影響，如經(jīng)脫水工藝加工的牛肉制品中亞硝酸鹽的含量明顯低于其他加工方式制備的牛肉制品，因此，通過研究肉及肉制品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量，可以幫助公眾合理選購及加工肉及肉制品，控制來自這些食品中的亞硝酸鹽和硝酸鹽的攝入量，減少因過量攝入亞硝酸鹽和硝酸鹽所帶來的健康隱患。

 

目前亞硝酸鹽和硝酸鹽檢測(cè)方法主要有分光光度法[5?7]、電化學(xué)法[8?11]和色譜法等。分光光度法由于部分肉及肉制品通常呈色澤較深，樣品溶液有顏色干擾，且鎘柱還原硝酸鹽過程非連續(xù)，面對(duì)大批量樣品檢測(cè)時(shí)耗時(shí)多，速度慢，而采用活性炭脫色后，硝酸鹽的測(cè)定仍會(huì)受到共軛離子和亞硝酸鹽的干擾，需要額外步驟來消除這些干擾因素。電化學(xué)方法電極的制備過程繁瑣且成本較高。高效毛細(xì)管電泳法[12?13]中的氯離子會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾，影響亞硝酸根離子的測(cè)定；離子色譜法[14?16]在測(cè)定部分肉及肉制品特別是以腌制、熏烤為工藝加工的產(chǎn)品時(shí)會(huì)因?yàn)楦啕}分而使Ag柱和Na柱的損耗增加，應(yīng)用受到一定的限制[17]?；诖?，筆者提出一種連續(xù)流動(dòng)分析-在線鎘柱還原法來同時(shí)測(cè)定肉及肉制品中的亞硝酸鹽和硝酸鹽，樣品經(jīng)處理沉淀蛋白質(zhì)、脫脂、制成樣品溶液后進(jìn)入連續(xù)流動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定。樣品溶液先經(jīng)膜分離器分離除雜脫色后，其中的亞硝酸鹽先與磺胺重氮化，再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紫紅色化合物，于538 nm波長處比色測(cè)定，得到亞硝酸鹽含量。同時(shí)，待測(cè)溶液中的硝酸鹽經(jīng)鎘柱還原為亞硝酸鹽，按同樣方法測(cè)得亞硝酸鹽總量，其中硝酸鹽含量即為亞硝酸鹽總量減去直接測(cè)得的亞硝酸鹽含量。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，該方法通過在線透析濾除雜質(zhì)，排除顏色干擾，結(jié)果準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，可同步、連續(xù)測(cè)定并即時(shí)得到亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量。

 

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

連續(xù)流動(dòng)分析儀：SAN++型，荷蘭Skalar公司。

振蕩水浴槽：SW22型，德國Julabo公司。

分析天平：AL204型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-特利多公司。

亞硝酸鈉、硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度均為200 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號(hào)分別為GBW(E) 100156、GBW(E) 100157，北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限公司。

三水亞鐵氰化鉀、二水乙酸鋅、冰乙酸、十水硼酸鈉、聚氧乙烯月桂醚、氯化銨、乙二胺四乙酸二鈉、氨水、磷酸、磺胺、鹽酸萘乙二胺：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 溶液配制

亞鐵氰化鉀溶液：106 g/L。稱取106 g亞鐵氰化鉀，加入約500 mL水溶解，移入1 000 mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線并混勻。

乙酸鋅溶液：220 g/L。稱取220 g二水乙酸鋅，加入30 mL冰乙酸和約500 mL水，加熱或超聲至其完全溶解，移入1 000 mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線并混勻。

飽和硼砂溶液：50 g/L。稱取50 g十水硼酸鈉，加入約500 mL熱水溶解，冷卻后移入1 000 mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線并混勻。

聚氧乙烯月桂醚溶液：0.3 g/mL。稱取30 g聚氧乙烯月桂醚，加入約50 mL水溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線并混勻。

氯化銨緩沖溶液：pH值為8.5。稱取85 g氯化銨和1.0 g乙二胺四乙酸二鈉溶于800 mL水中，混合均勻，用氨水調(diào)節(jié)pH值至8.5±0.1，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線并混勻，再加入1 mL聚氧乙烯月桂醚溶液。于0～4 ℃冰箱避光保存，有效期一周。

磺胺顯色液：將100.0 mL磷酸加入到600 mL水中，放置冷卻至室溫，再加入10.0 g磺胺和1.0 g鹽酸萘乙二胺，攪拌至全部溶解，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用水稀釋至標(biāo)線并混勻。于0～4 ℃冰箱避光保存，有效期一周。

亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)中間液：5.0 μg/mL。吸取亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.5 mL，置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至標(biāo)線，臨用現(xiàn)配。硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)中間液：5.0 μg/mL。吸取硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.0 mL，置于200 mL容量瓶中，加水稀釋至標(biāo)線，臨用現(xiàn)配。

亞硝酸鹽系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取0.0、0.25、0.50、1.00、3.00、5.00、10.0 mL亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)中間液，置于7只50 mL帶塞比色管中并加水定容至標(biāo)線，配制成亞硝酸鹽(以亞硝酸鈉計(jì))的質(zhì)量濃度分別為0.0、0.025、0.05、0.10、0.30、0.50、1.0 mg/L的亞硝酸鹽系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

硝酸鹽系列標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取0.0、2.50、5.00、10.0、15.0、25.0、50.0 mL硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別置于50 mL帶塞比色管中并加水稀釋至50 mL，配制成硝酸鹽(以硝酸鈉計(jì))的質(zhì)量濃度分別為0.0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.50、5.00 mg/L的硝酸鹽系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 儀器工作條件

電源類型：220 V、50 Hz的交流電源。

連續(xù)流動(dòng)分析儀：常溫下，在538 nm波長處進(jìn)行測(cè)試。其中，緩沖液的流量設(shè)置為1.0 mL/min，單個(gè)樣品進(jìn)樣體積為1.0 mL。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品處理及提取取

適量樣品粉碎至均勻粉末或制成勻漿，稱取5 g制備好的樣品，置于250 mL錐形瓶中，加入12.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液，再加入150 mL 70 ℃左右的水，混勻加蓋置于沸水浴中加熱15 min后取出，放置在冷水浴中冷卻至室溫，之后轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，加入5 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5 mL 220 g/L乙酸鋅溶液用以沉淀蛋白質(zhì)，然后加水定容至200 mL，振搖混勻，靜置30 min (必要時(shí)可增加離心操作保證濾液澄清)，將上清液用濾紙過濾并棄去初濾液30 mL，后續(xù)濾液備用。同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)，空白樣品溶液采用實(shí)驗(yàn)用水代替樣品，按前述同樣步驟操作。1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測(cè)定

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將標(biāo)準(zhǔn)工作液倒入樣品杯中，放置在樣品架上，由進(jìn)樣器按程序依次進(jìn)行取樣、測(cè)定。以亞硝酸鹽或硝酸鹽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，分光光度計(jì)測(cè)定信號(hào)值(峰高)為縱坐標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn)曲線的繪制。

(2) 樣品測(cè)定

將空白樣品溶液和樣品溶液按照上述相同的條件進(jìn)行測(cè)定，分別得到信號(hào)值(峰高)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品溶液中亞硝酸鹽(以亞硝酸鈉計(jì))或硝酸鹽(以硝酸鈉計(jì))的濃度。若樣品的亞硝酸鹽含量或硝酸鹽含量超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)范圍，應(yīng)進(jìn)行稀釋后再測(cè)定。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化選擇

2.1.1 稱樣質(zhì)量

分別選取稱樣質(zhì)量為1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 g進(jìn)行試驗(yàn)，亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定值隨稱樣質(zhì)量變化如圖1所示。由圖1可以看出，隨著稱樣質(zhì)量增加，亞硝酸鹽檢測(cè)含量逐漸上升，但在5.0 g后開始下降，最終確定稱樣質(zhì)量為5.0 g。

圖1   不同稱樣質(zhì)量時(shí)亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

Fig. 1   Mass fraction of nitrite in different sample weight

2.1.2 提取時(shí)間

分別在提取時(shí)間為5、10、15、20、25 min條件下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定值隨著提取時(shí)間增加有所上升，但在15 min后趨于穩(wěn)定，最終確定提取時(shí)間為15 min。

圖2   不同提取時(shí)間時(shí)亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

Fig. 2   Mass fraction of nitrite at different extraction time

2.1.3 沉淀劑選擇

乙酸鋅和亞鐵氰化鉀反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅沉淀具有很強(qiáng)的吸附能力，能夠有效地裹挾和吸附溶液中的蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的沉淀。相比其他沉淀劑，如硫酸銨、硫酸鈉等中性鹽，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀的沉淀效果更為顯著，且沉淀物更易于分離和去除，而三氯乙酸因其酸性條件與實(shí)驗(yàn)酸堿性條件不符，所以最終選擇乙酸鋅和亞鐵氰化鉀作為沉淀劑。

2.1.4 在線透析條件優(yōu)化

通過透析膜在線透析，在線濾除蛋白、脂肪等大分子化合物，很好地解決了顏色干擾問題，選擇紅腸類樣品使用不同品牌透析膜進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定值在Skalar透析膜條件下效果最好，最終確定透析膜為Skalar公司生產(chǎn)。

圖3   不同品牌透析膜時(shí)亞硝酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

Fig. 3   Mass fraction of nitrite in different brands of dialysis membranes

2.1.5 波長選擇使用亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行試驗(yàn)，在波長范圍為340～800 nm條件下進(jìn)行比色，繪制吸收曲線如圖4所示。由圖4可以看出，最大吸收波長為538 nm，故采用538 nm作為測(cè)定波長。

圖4   亞硝酸鹽吸收曲線

Fig. 4   Absorption curve of nitrite

2.1.6 鎘粒選擇

分別使用純鎘粒和鍍銅鎘粒裝填鎘柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察記錄鎘柱還原效率，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，鍍銅鎘粒相比純鎘粒具有更高的還原效率，因此選用鍍銅鎘粒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)效果最好。

圖5   不同鎘粒類別時(shí)鎘柱還原效率

Fig. 5   Cadmium column reduction efficiency in different cadmium particle categories

2.2 線性范圍及定量限

根據(jù)前述方法對(duì)亞硝酸鹽系列標(biāo)準(zhǔn)工作液和硝酸鹽系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)測(cè)得結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到線性回歸方程，結(jié)果列于表1。由表1可知，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度在0.025～1.0 mg/L內(nèi)、硝酸鹽質(zhì)量濃度在0.25～5.0 mg/L內(nèi)，兩者的質(zhì)量濃度與分光光度計(jì)信號(hào)值線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均超過0.999。根據(jù)GB/T 5009.1—2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法　理化部分　總則》附錄A的定義，把3倍空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(測(cè)定次數(shù)n≥20)相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量或濃度稱為檢出限，定量限為10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù)方法的稱樣量和定容體積，亞硝酸鹽檢出限為0.3 mg/kg，定量限為1 mg/kg，硝酸鹽檢出限為3 mg/kg，定量限為10 mg/kg。

表1   亞硝酸鹽及硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程及相關(guān)系數(shù)

Tab. 1   Linear regression equations，coefficients and linear ranges of standard curves

 

2.3 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

向5種肉及肉制品樣品中分別添加低、中、高3個(gè)不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述方法進(jìn)行樣品處理，之后再進(jìn)行亞硝酸鹽和硝酸鹽含量的測(cè)定，每個(gè)添加水平進(jìn)行6次平行測(cè)定后，分別計(jì)算亞硝酸鹽和硝酸鹽的加標(biāo)回收率并取均值作為最終結(jié)果，同時(shí)分別計(jì)算不同樣品不同水平濃度下測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2和表3。由表2和表3可知，亞硝酸鹽的平均加標(biāo)回收率為93.0%～103.3%，RSD為2.16%～7.55%；硝酸鹽的平均加標(biāo)回收率為95.8%～104.6%，RSD為3.49%～6.02%。該方法在亞硝酸鹽及硝酸鹽含量的檢測(cè)中具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，能夠滿足實(shí)際應(yīng)用需求。

表2   肉及肉制品中亞硝酸鹽加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 2   Results of the spiking test for the determination of nitrite in meat and meat products

 

表3   肉及肉制品中硝酸鹽加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 3   Results of the spiking test for the determination of nitrate in meat and meat products

 

3 結(jié)語

創(chuàng)新性地提出了一種高效、精確檢測(cè)肉及肉制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽含量的方法。相較于傳統(tǒng)手段，該方法巧妙利用透析技術(shù)在線濾除蛋白、脂肪等大分子雜質(zhì)，從根本上攻克了顏色干擾這一長期存在的技術(shù)難題。其操作簡便快捷，不僅顯著提升了檢測(cè)的靈敏度與準(zhǔn)確性，還憑借雙通道同步測(cè)定功能，實(shí)現(xiàn)了亞硝酸鹽與硝酸鹽含量的即時(shí)并行分析，極大地縮短了檢測(cè)周期，提高了工作效率。鑒于此方法的顯著優(yōu)勢(shì)，其在肉類及肉制品安全監(jiān)控領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，同時(shí)，也為其他食品中亞硝酸鹽及硝酸鹽含量的高效檢測(cè)開辟了全新的路徑，展現(xiàn)出廣闊的推廣與應(yīng)用潛力。

 

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