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摘 要： 建立了蒜薹中6種對羥基苯甲酸酯保鮮劑的快速分散固相萃取-氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。對羥基苯甲酸酯經(jīng)乙腈提取后，采用快速分散固相萃取法對樣品進行凈化，采用質(zhì)譜法檢測，外標法定量。6種對羥基苯甲酸酯質(zhì)量濃度在10～200 μg/L內(nèi)與對應色譜峰面積線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。6種對羥基苯甲酸酯的檢出限為2.61～3.13 μg/kg，定量限為8.70～10.43 μg/kg。樣品平均回收率為107.0%～117.4%，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.8%～9.7%（n=6）。該方法操作簡單、快速、準確，適用于蒜薹中對羥基苯甲酸酯保鮮劑的測定。

 

關(guān)鍵詞： 快速分散固相萃取法； 氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法； 蒜薹； 對羥基苯甲酸酯

 

對羥基苯甲酸酯具有良好的抑菌作用，是一種常用的抗菌防腐保鮮劑，在食品、飲料、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)有廣泛的應用[1?2]。與傳統(tǒng)的山梨酸及其鈉鹽、苯甲酸及其鈉鹽防腐保鮮劑相比，山梨酸和苯甲酸需要在酸性條件下才能有效抑制微生物的生長，其使用有一定的局限性，而對羥基苯甲酸酯類保鮮劑在pH值為4～8內(nèi)都能起到良好的抑菌作用，抑菌范圍廣，穩(wěn)定性好，因此對羥基苯甲酸的防腐效果優(yōu)于苯甲酸與山梨酸[3]。但有研究表明，接觸對羥基苯甲酸酯可干擾人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，且對人體細胞有一定的毒性，從而對人類健康產(chǎn)生有害后果[4?6]。

 

蒜薹是中國人最常食用的蔬菜之一，其生產(chǎn)季節(jié)主要集中在5～6月，通過及時貯藏延長供應期，保鮮期可長達8～10個月。蒜薹保鮮技術(shù)主要有冷藏法、化學保鮮法、生物保鮮法和氣調(diào)冷藏法[7]。對羥基苯甲酸酯類化合物可用作蔬菜的化學防腐保鮮劑，GB 2760—2014《食品國家安全標準　食品添加劑使用標準》規(guī)定蔬菜中可以使用的對羥基苯甲酸甲酯及其鈉鹽、對羥基苯甲酸乙酯及其鈉鹽(以對羥基苯甲酸計)的最大限量為12 mg/kg，日本規(guī)定蒜薹中可以使用的對羥基苯甲酸酯(乙酯、丙酯、異丙酯、丁酯、異丁酯)及其鈉鹽(以對羥基苯甲酸計)的限量為12 mg/kg。目前，對羥基苯甲酸酯測定方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[8?10]，研究對象多集中在調(diào)味品、水果、水產(chǎn)品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，對蔬菜基質(zhì)研究較少。GB 5009.31—2016《食品安全國家標準　食品中對羥基苯甲酸酯類的測定》中規(guī)定了針對醬油、醋、飲料及果醬中對羥基苯甲酸酯(甲酯、乙酯、丙酯和丁酯)的氣相色譜氫離子火焰(FID)檢測方法，但由于色譜法的局限性，容易出現(xiàn)假陽性的情況，而質(zhì)譜法在定性方面更具有優(yōu)勢。

 

食品檢測的樣品處理一般會經(jīng)過制備、提取、凈化、富集、分離等步驟[11]，常見的樣品處理技術(shù)包括液液萃取、固相萃取法、凝膠色譜法和快速分散固相萃取法等。快速分散固相萃取法采用溶劑對樣品進行提取，加入脫水劑使得水相和有機相分層，再加入凈化劑去除樣品中的有機酸、脂肪、色素等雜質(zhì)，其操作簡單、耗時少，可以在短時間內(nèi)處理大量樣品，有機溶劑使用量少，因此在食品檢測中的應用越來越廣泛[12?13]。筆者以蒜薹為研究對象，建立了快速分散固相萃取法-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丁酯和對羥基苯甲酸異丁酯的方法。

 

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent7890+7000B型，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：(1)ML204T/02型，感量為0.1 mg；(2)MS205DU，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

離心機：Sigma 3K15型，德國Sigma公司。

組織研磨機：SPEX GENO2010型，美國SPEX SamplePrep公司。

乙腈：色譜純，美國霍尼韋爾國際公司。

QuEChERS萃取鹽包：部件號為5982-7650，美國安捷倫科技有限公司。

QuEChERS凈化管：部件號為5982-5356CH，美國安捷倫科技有限公司。

對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸異丁酯標準物質(zhì)：質(zhì)量分數(shù)分別為99.25%、99.53%、99.06%、99.6%、99.76%、99.8%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 氣相色譜儀

色譜柱：HP-5MS毛細管柱 (30 m×0.25 mm，250 μm，美國安捷倫科技有限公司)；進樣口溫度：280 ℃；載氣：氦氣；流量：1.0 mL/min；進樣體積：1 μL；進樣方式：不分流進樣；程序升溫條件：起始溫度為100 ℃，以5 ℃/min升到150 ℃，保持2 min，再以40 ℃/min升到280 ℃，保持2 min。

1.2.2 質(zhì)譜儀

離子源溫度：280 ℃；四極桿溫度：150 ℃；接口溫度：280 ℃；電離方式：EI源；碰撞氣：高純氮氣；載氣：高純氦氣；監(jiān)測方式：多反應離子監(jiān)測(MRM)模式。

1.3 溶液配制

標準儲備溶液：分別準確稱取10.00 mg對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丁酯和對羥基苯甲酸異丁酯于6只10 mL容量瓶中，用乙腈定容至標線，配制成質(zhì)量濃度均為1.000 mg/mL的標準儲備液。

混合標準溶液：分別準確移取100 μL的各標準儲備液于一只100 mL容量瓶中，用乙腈定容至標線，配制成各組分質(zhì)量濃度均為1.000 mg/L的混合標準溶液。

基質(zhì)匹配混合標準工作溶液：將蒜薹空白樣品與樣品相同過程處理，制備空白基質(zhì)溶液，準確移取一定量的混合標準溶液，用空白基質(zhì)溶液配制各組分質(zhì)量濃度均為10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 μg/L的基質(zhì)匹配混合標準工作溶液。

樣品溶液：稱取10 g (精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入10.0 mL乙腈溶液和1顆瓷質(zhì)子，振蕩混勻。加入QuEChERS萃取鹽包，劇烈震蕩1 min，以9 500 r/min離心5 min。吸取6 mL上清液至QuEChERS凈化管中，渦旋混勻1 min，以9 500 r/min離心5 min，吸取上清液，作為樣品溶液。

1.4 實驗方法

取基質(zhì)標準曲線溶液和樣品溶液，按照1.2儀器工作條件進行測定，根據(jù)各組分的色譜峰面積外標法計算對羥基苯甲酸酯的殘留量。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

對羥基苯甲酸酯類化合物屬于極性中等偏強的化合物。楊飛帆等[14]分別用DB-FFAP、HP-FFAP、HP-INNOWAX、HP-WAX和HP-5MS等不同極性色譜柱對4種對羥基苯甲酸酯類化合物進行測定，呂穩(wěn)等[15]比較了HP-5MS，HP-FFAP和DB-624 3種極性色譜柱對16種防腐劑的分離情況，結(jié)果均表明HP-5MS柱在測定對羥基苯甲酸酯類化合物時分離度和重現(xiàn)性更好，色譜峰形更佳。分別考察了HP-INNOWAX (30 m×0.25 mm，250 μm)和HP-5MS (30 m×0.25 mm，250 μm)兩種不同極性毛細管色譜柱對6種對羥基苯甲酸酯類化合物的分離效果，結(jié)果表明，使用HP-INNOWAX色譜柱6種對羥基苯甲酸酯類化合物出峰時間較晚，而且對羥基苯甲酸甲酯和異丙酯沒有完全分離；HP-5MS色譜柱測定時間短，出峰更快，峰形尖銳對稱，能夠完全分離6種對羥基苯甲酸酯類化合物，與文獻結(jié)果一致，因此，選用HP-5MS色譜柱作為分析色譜柱。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

對羥基苯甲酸酯是由對羥基苯甲酸與相應醇類酯化形成的，在EI源轟擊作用下，其可能的裂解過程如圖1所示：脫去醇基碳鏈(CnH2n+1O—)，形成m/z 121的碎片離子，脫去酯基碳鏈(CnH2n+1OOC—)，形成m/z 93的碎片離子，烷基取代苯易發(fā)生α-碳和β-碳裂解，形成m/z 91的?鎓離子，?鎓離子進一步裂解，形成m/z 65的碎片離子。

圖1   對羥基苯甲酸酯類化合物可能的裂解途徑

Fig. 1   Possible cleavage pathways of parabens

采用串聯(lián)質(zhì)譜儀對10 mg/L的6種對羥基苯甲酸酯類化合物混合標準溶液進行母離子掃描，設(shè)置掃描范圍為m/z 20～300，6種對羥基苯甲酸酯類化合物的掃描質(zhì)譜圖如圖2所示，選擇質(zhì)荷比豐度高且不易受干擾的離子作為母離子。將選擇的母離子進行產(chǎn)物離子掃描，并對其碰撞能量進行優(yōu)化，結(jié)果見表1。優(yōu)化后的總離子流圖如圖3所示。

圖2   對羥基苯甲酸酯類化合物掃描質(zhì)譜圖

Fig. 2   Scanning mass spectrum of parabens

表1   6種對羥基苯甲酸酯類化合物質(zhì)譜參數(shù)

Tab. 1   Mass spectrum parameters of 6 kinds of parabens

 

1—對羥基苯甲酸甲酯；2—對羥基苯甲酸乙酯；3—對羥基苯甲酸異丙酯；　4—對羥基苯甲酸丙酯；5—對羥基苯甲酸異丁酯；6—對羥基苯甲酸丁酯

圖3　6種對羥基苯甲酸酯類化合物總離子流圖

Fig. 3   Total ion flow diagram of 6 kinds of p-hydroxybenzoates

2.3 樣品處理條件優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

快速分散固相萃取法作為蔬菜中農(nóng)藥殘留的樣品處理方法，廣泛使用乙腈和乙酸乙酯等作為提取溶劑。李燕等[16]比較了乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑測定醬油中6種對羥基苯甲酸酯類化合物，結(jié)果表明乙酸乙酯與乙腈的提取效果相近，回收率相當。比較了乙酸乙酯、乙腈和1%乙酸溶液-乙腈三種溶劑的提取效果，6種對羥基苯甲酸酯的回收率見圖4。由圖4可見，3種溶劑的提取效果并無顯著性差異。3種溶劑提取凈化后的溶液經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜法測定，經(jīng)乙腈提取的溶液雜質(zhì)影響較1%乙酸溶液-乙腈和乙酸乙酯更小(圖5)，故選取乙腈作為提取溶劑。

 1—對羥基苯甲酸甲酯；2—對羥基苯甲酸乙酯；3—對羥基苯甲酸異丙酯；4—對羥基苯甲酸丙酯；5—對羥基苯甲酸異丁酯；6—對羥基苯甲酸丁酯

圖4　不同提取溶劑的回收率

Fig. 4   Recovery of different extraction solvents

圖5   不同溶劑凈化效果比較

Fig. 5   Comparison of purification effect of different solvents

2.3.2 QuEChERS凈化材料的選擇QuEChERS凈化材料主要有PSA、C18、石墨化炭黑(GCB)和無水硫酸鎂等，通過不同的配比去除不同基質(zhì)中的干擾雜質(zhì)，提高靈敏度和回收率。蒜薹中的雜質(zhì)主要是水分和色素，無水硫酸鎂主要是吸收樣品中的水分，PSA具有去除樣品中色素的作用，GCB可以去除平面結(jié)構(gòu)中的葉綠素，因此選用900 mg MgSO4-150 mg PSA-45 mg GCB的凈化材料對蒜薹進行凈化處理。

2.4 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應是目標化合物在樣品基質(zhì)中的響應與其在純?nèi)軇┲械捻憫啾仍龃蠡驕p小，使得測量結(jié)果出現(xiàn)偏差的一種現(xiàn)象，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的基質(zhì)效應一般以增強為主[17]?；|(zhì)效應計算公式為：EM=(A/B-1)×100%，A為基質(zhì)標準曲線斜率，B為溶劑標準曲線斜率。當EM＞0時，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，當EM＜0時，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應；|EM|≤20%為弱基質(zhì)效應，20%＜|EM|≤50%為中等基質(zhì)效應，|EM|＞50%為強基質(zhì)效應[18]。蒜薹中6種對羥基苯甲酸酯類化合物的基質(zhì)效應見表2。由表2可知，6種對羥基苯甲酸酯類化合物均表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應，且為強基質(zhì)效應，在實際測定時需采用基質(zhì)標準曲線進行校正。

表2   蒜薹中6種對羥基苯甲酸酯類化合物的基質(zhì)效應

Tab. 2   Matrix effects of 6 parabens in garlic shoots

 

2.5 檢出限、定量限和線性回歸方程

配制6種對羥基苯甲酸酯類化合物質(zhì)量濃度均為10～200 μg/L的基質(zhì)匹配混合標準工作溶液，以定量離子對的色譜峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性回歸分析，向空白基質(zhì)溶液中添加6種對羥基苯甲酸酯類化合物，將信噪比為3時的添加濃度作為檢出限，信噪比為10時的添加濃度作為定量限，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在所測定濃度范圍內(nèi)，標準曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

表3   6種對羥基苯甲酸酯類化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

Tab. 3   Linear regression equation, correlation coefficient, limit of detection and limit of quantitation of 6 parabens

 

2.6 樣品加標回收試驗

以空白蒜薹為基質(zhì)，分別添加10、20、50 μg/kg的質(zhì)量濃度水平，每個濃度水平重復測定6次，3個濃度水平的平均回收率和測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)分別見表4。由表4可知，6種對羥基苯甲酸酯類化合物的加標平均回收率為107.0%～117.4%，RSD為0.8%～9.7%，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范　食品理化檢測》的要求。

表4   6種對羥基苯甲酸酯類化合物加標回收試驗結(jié)果(n=6)

Tab.4   Recovery test results of 6 kinds of p-hydroxybenzoate compounds by standard addition method(n=6)

 

3 結(jié)論

建立了快速分散固相萃取法結(jié)合氣相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定蒜薹中6種對羥基苯甲酸酯類保鮮劑的殘留量?？焖俜稚⒐滔噍腿》ú僮骱唵危臅r少，氣相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法定性定量準確度高，精密度好，適用于蒜薹中對羥基苯甲酸酯類化合物殘留量的測定。蔬菜水果中添加的保鮮劑種類繁多，包括對羥基苯甲酸酯類、噻苯咪唑、鄰苯基苯酚、聯(lián)苯及農(nóng)藥類等，該方法僅針對蒜薹中的對羥基苯甲酸酯類保鮮劑殘留量進行方法開發(fā)，其他蔬菜水果基質(zhì)以及其他類保鮮劑殘留量的測定方法仍需更進一步的研究。

 

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