多糖作為自然界中至關(guān)重要的大分子，近年來(lái)因其廣泛的生物活性而備受關(guān)注。然而，由于多糖結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征極具挑戰(zhàn)性。許多多糖在組成上具有異質(zhì)性，單糖組成也存在差異，因此確定單糖組成是分析多糖結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵步驟。目前在多種分析多糖中單糖組成的方法中，先水解后衍生，再用氣相色譜或液相色譜結(jié)合質(zhì)譜法分析多糖成分的方法雖然廣受歡迎，但難以辨別單糖的絕對(duì)構(gòu)。D-構(gòu)型單糖雖然在天然糖類中占主導(dǎo)地位，但L-構(gòu)型單糖也廣泛分布于各種多糖中。因此，準(zhǔn)確確定單糖的絕對(duì)構(gòu)型對(duì)于多糖的全面結(jié)構(gòu)分析至關(guān)重要。
一、研究背景
利用手性色譜適合用于單糖對(duì)映體的分離。然而，昂貴的色譜柱成本阻礙了它的廣泛使用。與對(duì)映體相比，在單糖分子中引入一個(gè)同種構(gòu)型的新手性中心，將對(duì)映異構(gòu)體變?yōu)榉菍?duì)映異構(gòu)體。非對(duì)映體可以通過(guò)傳統(tǒng)的C18反相柱達(dá)到分離效果。近期，我們團(tuán)隊(duì)以 L-半胱氨酸甲酯衍生化（CMED）和超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）為基礎(chǔ)，結(jié)合Full scan掃描模式和SIM掃描模式對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析和鑒別，開發(fā)了一種可同時(shí)測(cè)定多糖的單糖類型及其 D/L 構(gòu)型的新方法，用于單糖類型的綜合分析。該方法可同時(shí)表征醛糖、酮糖、糖醛酸和糖醇，并對(duì)反應(yīng)機(jī)理和副產(chǎn)物進(jìn)行了詳細(xì)分析，為新方法提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
二、研究結(jié)果
1. 基于UPLC-MS確定L-半胱氨酸甲酯的衍生機(jī)理
CMED衍生法的機(jī)理分析
CMED衍生過(guò)程分兩步反應(yīng)進(jìn)行。第一步醛糖、酮糖和糖醛酸的羰基與L-半胱氨酸甲酯之間的親核加成反應(yīng)形成噻唑烷或席夫堿衍生物；第二步，單糖羥基的乙?；?。根據(jù)R.G.Kallen等人的研究，第一步的產(chǎn)物以噻唑烷或席夫堿形式存在，它們可以發(fā)生異構(gòu)化(圖A)。 根據(jù)質(zhì)譜和核磁共振（NMR）檢測(cè)到的主要產(chǎn)物（圖1B-D）和副產(chǎn)推斷出了醛糖、酮糖、糖醛酸和糖醇的詳細(xì)衍生過(guò)程。
圖1 單糖衍生原理
CMED衍生法產(chǎn)物和副產(chǎn)物分析
使用Q Exactive Focus-Orbitrap MS的全掃描模式對(duì)CMED衍生方法的主產(chǎn)物和副產(chǎn)物進(jìn)行分析。由于醛糖與L-半胱氨酸甲酯的反應(yīng)可以同時(shí)生成席夫堿和噻唑烷，因此副產(chǎn)物主要來(lái)源于兩者。在進(jìn)行產(chǎn)物和副產(chǎn)物分析時(shí)，研究根據(jù)Thermo Scientific Mass Frontier 軟件預(yù)測(cè)醛糖、酮糖和糖醛酸衍生物的碎片離子，在這些單糖衍生物中檢測(cè)到了希夫堿和/或噻唑烷的產(chǎn)物峰。對(duì)于醛糖，以L-Ara為例，主產(chǎn)物為希夫堿衍生物，副產(chǎn)物為噻唑烷衍生物（圖A）。根據(jù)LC-MS和NMR檢測(cè)結(jié)果，表明酮糖的主產(chǎn)物為希夫堿（圖B和圖3C），由于雙鍵的存在，所以產(chǎn)生兩個(gè)順?lè)串悩?gòu)的色譜峰。與醛糖和酮糖不同，糖醛酸除了生成噻唑烷外，還在堿性條件下通過(guò)消除反應(yīng)在C-4和C-5位生成雙鍵（圖C）。糖醇因不含醛基，副產(chǎn)物為L(zhǎng)-半胱氨酸甲酯與醋酐的產(chǎn)物（圖D）。
圖2 Q Exactive Focus-Orbitrap MS 分析不同單糖CMED產(chǎn)物的LC-MS全掃描色譜圖
圖3各種衍生物的 13C-NMR 數(shù)據(jù)對(duì)比（150 MHz，CD4OD）
2. CMED衍生方法的優(yōu)化
CMED衍生受到反應(yīng)溫度和時(shí)間的影響。研究通過(guò)控制兩步實(shí)驗(yàn)中的不同反應(yīng)時(shí)間和溫度來(lái)確定最佳衍生條件。首先，在60、70和80℃下用L-半胱氨酸甲酯衍生L-Rib 1小時(shí)，并在60℃下以醋酸酐乙?；?0分鐘，結(jié)果表明副產(chǎn)物的總量在70℃下最少，這表明70℃更有利于衍生。隨后，在70℃下以不同的反應(yīng)時(shí)間(30、45和60分鐘)衍生L-Rib，并且確定反應(yīng)時(shí)間沒有顯著影響最終衍生的產(chǎn)物。為確保反應(yīng)完全，選擇60分鐘作為反應(yīng)時(shí)間。確定第一步反應(yīng)的最佳條件后，以L-Rib在60、70、80、90和100℃下確定第二步的最佳反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)皆為30分鐘。發(fā)現(xiàn)副產(chǎn)物的量隨著反應(yīng)溫度的升高而增加。因此，羥基乙酰化的最佳溫度被確定為60℃（圖4）。
圖4 不同溫度對(duì) L-Rib 乙?；^(guò)程中產(chǎn)品產(chǎn)量的影響
3. 液相色譜和Q Exactive Focus-Orbitrap MS方法的優(yōu)化
為實(shí)現(xiàn)單糖衍生物在液相色譜中達(dá)到較好的分離效果，對(duì)液相色譜方法的洗脫梯度、柱溫和流速等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。流動(dòng)相為0.2%FA–乙腈(A)和0.1% FA–水(B)。在未優(yōu)化液相方法之前，發(fā)現(xiàn)這些單糖衍生物的色譜峰有大量疊加的現(xiàn)象（圖A）。因此，研究?jī)?yōu)化了色譜洗脫梯度，新的液相色譜洗脫梯度可以實(shí)現(xiàn)大多數(shù)衍生物相互分離。此外，為了獲得更好的分離度，色譜柱的溫度和流動(dòng)相的流速設(shè)置也進(jìn)行了優(yōu)化，顯著提高了色譜峰之間的分離度（圖B）。同時(shí)為了提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度，減少噪音和副產(chǎn)物的干擾，我們優(yōu)化了質(zhì)譜儀的掃描參數(shù)，將正離子模式下的全掃描切換為 SIM 掃描模式。
圖5 液相色譜洗脫梯度條件對(duì)衍生物分離的影響
4.應(yīng)用實(shí)例
為了驗(yàn)證方法在天然多糖分析中的實(shí)用性，研究選用了黃芪多糖、人參多糖、鎖陽(yáng)多糖、蟲草多糖、蕨麻多糖和沙棘多糖對(duì)方法進(jìn)行了分析驗(yàn)證（圖B-G）。結(jié)果顯示，該方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定多糖中單糖的類型和絕對(duì)構(gòu)型，并且與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致。在分析的多糖樣品中，六種多糖都含有D-Glc，而D-Xyl、L-Ara、D-Man和D-Gal在這些多糖的成分中也經(jīng)常出現(xiàn)。這種反復(fù)出現(xiàn)的現(xiàn)象表明，這些植物多糖的結(jié)構(gòu)組成具有顯著的共性。
圖6 利用 CMED 方法研究各種植物多糖的單糖組成
在本研究中，為了提高L-半胱氨酸甲酯衍生方法(CMED)的適用性，我們用乙酸酐替代異硫氰酸苯酯，從而使其可用于醛糖、酮糖、糖醛酸和糖醇的分析，鑒定了包含9對(duì)對(duì)映體在內(nèi)的26種單糖。根據(jù)質(zhì)譜裂解模式確定了反應(yīng)機(jī)理和可能的副產(chǎn)物。此外，還利用該方法對(duì)副產(chǎn)物和產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了討論分析，在未來(lái)將側(cè)重于提高衍生化的穩(wěn)定性和效率，以及擴(kuò)大方法的范圍，包括更多類型的稀有單糖。
以上研究成果“Simultaneous determination of the monosaccharide types and their absolute configurations in polysaccharides based on UPLC-MS/MS”已發(fā)表在國(guó)際知名期刊International Journal of Biological Macromolecules（IF=7.7，中科院1區(qū)TOP期刊）。青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)系專業(yè)碩士研究生黃永春和白潔為共同第一作者，國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張壽德老師為通訊作者。本研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金（22067016）和青海省自然科學(xué)基金（2021-QY-203）的資助。
參考文獻(xiàn)
Simultaneous determination of the monosaccharide types and their absolute configurations in polysaccharides based on UPLC-MS/MS. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2025.139647
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