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近期，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院張文斌教授和王雅楠副研究員在科愛創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上發(fā)表研究文章：一種用以調(diào)節(jié)凝血-炎癥相互作用的微環(huán)境響應(yīng)血管支架涂層新策略。本研究通過該涂層抑制血小板-纖維蛋白相互作用和血小板-單核細(xì)胞聚集體的形成，有效干擾凝血和炎癥反應(yīng)互作，為優(yōu)化血管支架設(shè)計(jì)提供了新的見解。

01研究內(nèi)容簡介

心血管支架雖能通過機(jī)械支撐改善血管狹窄，但再內(nèi)皮化延遲、血栓形成、持續(xù)性炎癥及晚期支架內(nèi)再狹窄仍限制其長期療效。支架植入后引發(fā)內(nèi)皮損傷、炎癥、凝血及內(nèi)膜增生級聯(lián)反應(yīng)，其中凝血與炎癥通過血小板活化相互作用：血小板通過釋放細(xì)胞因子（如TNF-α）增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞（SMCs）遷移增殖，并介導(dǎo)單核細(xì)胞聚集，加劇細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解與病理性重塑，最終導(dǎo)致管腔狹窄。本研究提出微環(huán)境響應(yīng)性涂層策略：1）采用血小板整合素受體（Gp IIb/IIIa）拮抗劑替羅非班以抑制凝血級聯(lián)反應(yīng)；2）設(shè)計(jì)MMP9響應(yīng)性納米顆粒負(fù)載丹酚酸A（Sal A），在炎癥部位靶向釋放以抑制MMP9過度表達(dá)，調(diào)節(jié)單核-巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制SMCs的異常增殖并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞再生。通過層層自組裝技術(shù)整合功能組分，該涂層在動(dòng)脈粥樣硬化兔模型中證實(shí)可協(xié)同調(diào)控凝血-炎癥網(wǎng)絡(luò)，減少血栓形成與炎性因子分泌，加速功能性內(nèi)皮層的修復(fù)，并抑制病理性內(nèi)膜增生。該策略通過全程動(dòng)態(tài)調(diào)控組織反應(yīng)，為改善血管支架在動(dòng)脈粥樣硬化環(huán)境中的長期功能提供了創(chuàng)新性解決方案（圖1）。

圖1：涂層制備示意圖及工作方式。PDA：聚多巴胺、PEI：聚亞胺、GS：納米粒子、Sal A：丹酚酸A、TIR：替羅非班、OxHA：氧化透明質(zhì)酸

一、響應(yīng)性涂層的設(shè)計(jì)流程

采用EDC/NHS交聯(lián)法制備了4-羧基苯基硼酸-明膠復(fù)合物（CPBA-GEL），并通過¹H NMR驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。利用硼酯化反應(yīng)將丹參酮A（Sal A）與CPBA-GEL交聯(lián)，形成粒徑約100 nm的納米顆粒（GS）。實(shí)驗(yàn)表明，MMP9可特異性觸發(fā)Sal A釋放：10 nM MMP9作用180分鐘后釋放率達(dá)80%，而無酶對照組僅為20%，背景釋放源于苯硼酯鍵水解及表面分子解附。通過層層自組裝構(gòu)建了PEI/TIR/GS/OxHA功能涂層，紫外光譜證實(shí)GS成功嵌入。替羅非班釋放實(shí)驗(yàn)顯示，含GS的涂層具有顯著的緩釋效果，20天內(nèi)釋放速率低于對照組，歸因于GS通過氫鍵、π-π堆積等作用阻滯藥物擴(kuò)散，且納米顆粒形成了物理屏障。SEM/AFM分析表明涂層表面均勻，GS的引入并未顯著增加粗糙度，但提升了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。因此GS納米顆粒不僅賦予涂層MMP9響應(yīng)釋藥的功能，還通過多重分子作用優(yōu)化了藥物的緩釋性能和涂層的結(jié)構(gòu)完整性。

圖2：GS納米顆粒及其涂層的表征。(A) 納米顆粒制備示意圖。(B) GS納米顆粒的粒徑。(C) 37℃下，MMP9響應(yīng)的GS納米顆粒在含有0、1、5和10 nM MMP9的PBS中釋放的累積Sal A。(D) Sal A、PEI/OxHA、PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA和PEI/TIR/GS/OxHA的紫外可見光譜。(E) PEI/TIR/OxHA和PEI/TIR/GS/OxHA在PBS中37℃時(shí)的累積替羅非班釋放量。（F-G）不同涂層樣品的SEM和AFM圖像。標(biāo)尺，10 μm。

二、涂層對血小板聚集的抑制

血小板是凝血與炎癥的關(guān)鍵調(diào)控因子，其活化抑制對相關(guān)病理過程具有調(diào)節(jié)作用。本研究通過涂層負(fù)載抗凝劑替羅非班來實(shí)現(xiàn)凝血調(diào)控?？寡▽?shí)驗(yàn)顯示，對照組表面呈現(xiàn)大量活化血小板，而PEI/OxHA和PEI/GS/OxHA組活化血小板數(shù)量顯著降低，其中PEI/TIR/OxHA組因替羅非班作用呈現(xiàn)最強(qiáng)抑制效果，PEI/TIR/GS/OxHA組則展現(xiàn)出綜合性能最優(yōu)。過氧化氫(H2O2)會加劇凝血反應(yīng)，含Sal A的GS納米顆粒通過清除自由基增強(qiáng)抗凝效果。在H2O2暴露實(shí)驗(yàn)中，對照組與PEI/OxHA組血小板活化顯著加劇，PEI/GS/OxHA和PEI/TIR/OxHA組僅出現(xiàn)輕度活化，而PEI/TIR/GS/OxHA組仍保持最佳抗血小板活化性能。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，替羅非班是抗凝作用的主要貢獻(xiàn)者，而GS納米顆粒的抗氧化能力則為其提供了重要協(xié)同支持。

圖3：涂層的血液相容性和抗炎能力。(A) 在H2O2刺激和不刺激的情況下，涂層上的血小板粘附和活化實(shí)驗(yàn)。標(biāo)尺，10 μm。(B) PMA和LPS處理涂層48小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)和THP-1 ROS生成圖像。標(biāo)尺：50 μm、100 μm。(C) PMA和LPS處理THP-1后ROS表達(dá)的定量統(tǒng)計(jì)。(D) ELISA試劑盒檢測THP-1血清IL 6和IL 1β水平。(E) ELISA試劑盒檢測THP-1中MMP9的表達(dá)。（F-G） PMA和LPS處理THP-1的定量結(jié)果和細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)譜圖。青色點(diǎn)、紅色點(diǎn)和黃色點(diǎn)分別代表CD68?、CD206?和CD86?細(xì)胞群。

三、涂層對單核細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)

血管支架的抗炎能力對其功能至關(guān)重要，因其植入后需應(yīng)對單核細(xì)胞募集引發(fā)的炎癥反應(yīng)。激活的單核細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化會加劇凝血及內(nèi)皮化障礙。研究采用PMA和LPS刺激THP-1細(xì)胞，通過不同涂層（PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA等）共培養(yǎng)48小時(shí)后觀察發(fā)現(xiàn)：涂層組THP-1細(xì)胞黏附量減少，其中PEI/GS/OxHA因GS抗炎作用顯著降低活化細(xì)胞的數(shù)量，細(xì)胞形態(tài)呈卵形；PEI/TIR/OxHA組仍存在假足狀弱活化細(xì)胞，而PEI/TIR/GS/OxHA對單核細(xì)胞活化抑制效果最優(yōu)。ROS檢測顯示其生成趨勢與細(xì)胞活化形態(tài)一致，PEI/TIR/GS/OxHA顯著抑制ROS水平，并降低促炎因子IL-1β、IL-6釋放。GS納米顆粒同時(shí)抑制炎癥微環(huán)境中單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的MMP9表達(dá)。流式分析表明，PEI/TIR/GS/OxHA組THP-1細(xì)胞CD206（M2表型標(biāo)志）表達(dá)上調(diào)，CD86（M1表型標(biāo)志）下調(diào)，CD206/CD86比值顯著升高，證實(shí)其促進(jìn)了M2抗炎表型分化。綜上，PEI/TIR/GS/OxHA通過調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、表型分化及炎癥因子分泌，展現(xiàn)出優(yōu)異的抗炎性能。綜上所述，PEI/TIR/GS/OxHA通過調(diào)節(jié)單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和蛋白的形態(tài)、分化和表達(dá)表現(xiàn)出優(yōu)越的抗炎能力。 

四、凝血與炎癥相互作用的影響

血栓形成涉及纖維蛋白、血小板與白細(xì)胞之間的凝血-炎癥相互作用?；罨难“逋ㄟ^CD61（Gp IIb/IIIa）受體與纖維蛋白原結(jié)合形成聚集，替羅非班作為Gp IIb/IIIa拮抗劑可抑制該過程。免疫熒光顯示，對照組和PEI/OxHA組存在密集纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)及血小板相互作用，而PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA及PEI/TIR/GS/OxHA組纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)顯著減少，平均分支長度縮短，其中替羅非班聯(lián)合GS的PEI/TIR/GS/OxHA抑制效果最優(yōu)。

單核細(xì)胞通過CD62p與血小板形成聚集體以促進(jìn)血栓的形成。實(shí)驗(yàn)表明，PEI/TIR/OxHA組單核細(xì)胞更圓且分散，血小板-單核細(xì)胞聚集減少；PEI/TIR/GS/OxHA因GS與替羅非班協(xié)同作用，CD11b?單核細(xì)胞及聚集體數(shù)量最低。該涂層通過拮抗Gp IIb/IIIa來抑制血小板聚集與纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)形成，同時(shí)干擾單核細(xì)胞活化及血小板-單核細(xì)胞相互作用，兼具抗炎抗凝特性，顯著調(diào)控血栓形成與炎癥進(jìn)程。

圖4：血栓與炎癥的相互作用分析。(A)細(xì)胞制備示意圖。(B) LPS處理24小時(shí)后纖維蛋白和CD61?血小板粘附在涂層上的圖像。擴(kuò)增的位置用白色方塊標(biāo)記。標(biāo)尺：40 μm和20 μm。(C) LPS處理24小時(shí)后涂層上CD11b?單核細(xì)胞和CD62p?血小板的圖像。標(biāo)尺，20 μm。(D)纖維蛋白與CD61?細(xì)胞的面積比。(E)纖維蛋白在涂層上的平均分支長度。(F) CD11b? CD62p?區(qū)域與CD62p?區(qū)域的面積比。采用單因素方差分析（ANOVA， t檢驗(yàn)）判定不同樣本間的差異。

五、SMCs對增殖和遷移的調(diào)控

血管支架植入后，平滑肌細(xì)胞（SMC）過度增殖和遷移是導(dǎo)致再狹窄的關(guān)鍵因素。本研究通過PDGF-BB刺激HUASMCs以模擬病理狀態(tài)，評估不同涂層對細(xì)胞行為的影響。EDU實(shí)驗(yàn)顯示，含GS納米顆粒的PEI/GS/OxHA和PEI/TIR/GS/OxHA組顯著抑制HUASMC增殖，共培養(yǎng)模型中PEI/TIR/GS/OxHA表面HUASMC/HUAEC比例最低，體現(xiàn)了選擇性抑制特性。QPCR和Western blot證實(shí)該涂層下調(diào)PCNA、CCND1基因及Cyclin D1蛋白表達(dá)水平，提示其通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)分子抑制增殖。遷移實(shí)驗(yàn)表明，PEI/TIR/GS/OxHA組可抑制MMP2/MMP9 的mRNA和蛋白表達(dá)，Transwell結(jié)果顯示24小時(shí)遷移抑制效果最優(yōu)，證實(shí)GS納米顆粒通過調(diào)節(jié)ECM降解機(jī)制限制細(xì)胞遷移。

總的來說，這些結(jié)果表明，加入GS納米顆粒增強(qiáng)了材料在影響平滑肌行為方面的功能。該涂層可有效調(diào)節(jié)與平滑肌細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的蛋白和基因的表達(dá)，在調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞紊亂引起的內(nèi)膜狹窄方面具有潛力。

圖5：平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控。(A) PDGF-BB處理48h后涂層上HUASMC的增殖情況。標(biāo)尺，200 μm。(B)定量分析EDU?細(xì)胞比例。（C-D）涂層上共培養(yǎng)24h后HUASMCs和HUAECs的免疫熒光圖像定量統(tǒng)計(jì)。標(biāo)尺，100 μm。(E) PDGF-BB治療48小時(shí)后HUASMCs中PCNA和CCND1   mRNA水平。（F-H） PDGF-BB治療后HUASMCs中PCNA和Cyclin D1的Western   blot分析。(I) PDGF-BB治療48小時(shí)后HUASMCs中MMP2和MMP9的mRNA水平。(J) ELISA試劑盒檢測HUASMCs中MMP2和MMP9的表達(dá)。（K-L）結(jié)晶紫染色12和24小時(shí)transwell遷移的HUASMCs的定量統(tǒng)計(jì)和圖像。標(biāo)尺，200 μm。

六、涂層促進(jìn)血管支架組織再生

血管支架用于治療動(dòng)脈粥樣硬化性血管狹窄，但其植入后需應(yīng)對復(fù)雜的病理微環(huán)境。本研究通過球囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)建立兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，評估不同涂層修飾PLA支架植入腹主動(dòng)脈后的修復(fù)效果。結(jié)果顯示，損傷血管斑塊周圍CD68高表達(dá)，而PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA及PEI/TIR/GS/OxHA組CD68顯著降低：PEI/GS/OxHA通過GS納米顆粒的抗氧化與抗炎特性抑制炎癥；PEI/TIR/OxHA可能通過減少血小板-巨噬細(xì)胞聚集體形成減輕炎癥；PEI/TIR/GS/OxHA協(xié)同調(diào)控巨噬細(xì)胞表型及凝血-炎癥交互作用，展現(xiàn)出最強(qiáng)的抗炎能力。收縮型平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物αSMA和SM22α在PEI/GS/OxHA及PEI/TIR/GS/OxHA組表達(dá)顯著高于裸支架組，其中PEI/TIR/GS/OxHA因GS抑制SMCs異常增殖遷移而達(dá)到最高水平。HE染色顯示該組新生內(nèi)膜最薄，油紅O染色提示其斑塊脂質(zhì)含量最低。免疫熒光顯示PEI/TIR/GS/OxHA組CD31陽性細(xì)胞數(shù)最多，eNOS表達(dá)同步升高，表明其顯著促進(jìn)再內(nèi)皮化。綜上，PEI/TIR/GS/OxHA涂層通過調(diào)控炎癥、改善SMCs功能、減少脂質(zhì)沉積及促進(jìn)內(nèi)皮再生實(shí)現(xiàn)了血管修復(fù)，其協(xié)同調(diào)控凝血-炎癥網(wǎng)絡(luò)與SMCs行為的策略為動(dòng)脈粥樣硬化治療提供新方向。

圖6：動(dòng)脈粥樣硬化兔支架植入術(shù)。(A)兔支架植入研究方案。（B-E）支架植入后腹主動(dòng)脈CD68、SM22α表達(dá)的代表性免疫組化圖像及定量統(tǒng)計(jì)。標(biāo)尺，100 μm。(F)植入支架的腹主動(dòng)脈組織學(xué)分析。標(biāo)尺：400 μm、100 μm。(G)支架植入后內(nèi)膜厚度定量分析。（H-I） ORO染色支架代表性圖像及定量統(tǒng)計(jì)。比例尺，400和40 μm。(J)家兔腹主動(dòng)脈和血管支架內(nèi)表面的代表性SEM圖像。有代表性的定向細(xì)胞用紅色箭頭標(biāo)記。標(biāo)尺，50 μm。(K)血管和新生內(nèi)膜組織中CD31和eNOS的表達(dá)。血管支架柱用白色虛線標(biāo)記。標(biāo)尺，200 μm。（L-M）腹主動(dòng)脈支架內(nèi)CD31和eNOS表達(dá)的定量統(tǒng)計(jì)。

七、涂層促進(jìn)血管支架組織再生

本研究通過對兔腹主動(dòng)脈支架植入6周后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，評估涂層修飾對血管修復(fù)的影響?；驘釄D及維恩圖顯示，PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA、PEI/TIR/GS/OxHA組較PLA組存在顯著差異基因。凝血相關(guān)基因ITGA3和SELP表達(dá)在替羅非班處理后下降，聯(lián)合GS納米顆粒后抑制效果增強(qiáng)。GS納米顆粒上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IL-10和ARG1，下調(diào)IL-18和IL-1β，促進(jìn)了抗炎表型轉(zhuǎn)換。內(nèi)皮與平滑肌標(biāo)志物同步變化證實(shí)GS與替羅非班協(xié)同調(diào)控細(xì)胞功能。富集分析表明，PEI/GS/OxHA組主要關(guān)聯(lián)巨噬細(xì)胞分化及MAPK通路；PEI/TIR/OxHA組富集于凝血及IL-17炎癥通路；PEI/TIR/GS/OxHA組顯著富集凝血反應(yīng)、ROS通路、VEGF信號及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)通路，GSEA進(jìn)一步顯示其與脂質(zhì)代謝、PPAR信號及膽固醇代謝相關(guān)，提示聯(lián)合涂層通過調(diào)控脂代謝抑制斑塊進(jìn)展。PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選出COL1A2、COL5A2及SERPINF2等關(guān)鍵基因，參與膠原重構(gòu)與細(xì)胞分化，與抗凝及平滑肌表型轉(zhuǎn)換機(jī)制一致。綜上，PEI/GS/OxHA側(cè)重于抗炎，PEI/TIR/OxHA主攻抗凝，而PEI/TIR/GS/OxHA聯(lián)合涂層通過協(xié)同抑制炎癥-凝血級聯(lián)及調(diào)節(jié)脂代謝，實(shí)現(xiàn)血管微環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)控。

圖7：改良支架涂層在血管修復(fù)中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。(A)五組間基因表達(dá)熱圖。(B)   PEI/OxHA、PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA、PEI/TIR/GS/OxHA組和PLA組之間基因差異表達(dá)的維恩圖。（C-F）考慮內(nèi)皮細(xì)胞功能、SMC表型轉(zhuǎn)變、凝血過程和炎癥反應(yīng)的堆疊小提琴圖代表基因表達(dá)譜。（G-I） PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA和PEI/TIR/GS/OxHA對PLA的GO富集分析。（J-L） PLA與PEI/GS/OxHA、PEI/TIR/OxHA和PEI/TIR/GS/OxHA的KEGG富集分析。PEI/TIR/GS/OxHA組與PLA組間的（M-O） GSEA富集分析。(P)   Cytoscape中CytoHubba描述的前10個(gè)Hub基因的網(wǎng)絡(luò)圖。使用MCC評分對前10個(gè)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排名，并以紫色從暗到亮表示。