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摘 要： 建立了高效液相色譜法同時檢測化妝品中迪高替尼、托法替尼、烏帕替尼、魯索替尼4種組分。樣品用體積分數(shù)為80%的甲醇溶液提取，C18色譜柱分離，二極管陣列檢測器檢測，檢測波長為225 nm。4種組分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與對應(yīng)的色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.999 9；4種組分的檢出限為2.48～2.83 μg/g；霜類、乳液類、水劑類3種化妝品基質(zhì)下，方法回收率為92.6%～100.6%，測定結(jié)果相對標準偏差為0.2%～4.1%（n=6）。該方法操作簡便、準確快速，適用于化妝品中迪高替尼等4種組分的含量測定。

 

關(guān)鍵詞： 高效液相色譜法； 化妝品； 迪高替尼； 托法替尼； 烏帕替尼； 魯索替尼

 

特應(yīng)性皮炎(AD)是皮膚科常見疾病之一，是一種慢性炎癥性皮膚病，臨床上以皮膚瘙癢、復發(fā)性濕疹樣皮疹為特點，兒童患病率大，嚴重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量[1?2]。目前，AD的病因尚不完全明確，但有文獻報道Janus激酶抑制劑(JAKi)通過阻斷Janus激酶的信號通路，抑制Ⅱ型細胞因子而對AD的治療有一定效果[3?5]。近年來，多種JAKi獲批用于治療AD，其中烏帕替尼、迪高替尼、魯索替尼和托法替尼是目前臨床最為常用或是最具潛力的Janus激酶抑制劑[6?14]?！痘瘖y品監(jiān)督管理條例》第五十九條第三項規(guī)定，不得使用禁止用于化妝品生產(chǎn)的原料生產(chǎn)化妝品，不得在化妝品中添加可能危害人體健康的物質(zhì)。上述幾種JAKi類藥物，由于其良好的治療AD效果，有被不法化妝品生產(chǎn)企業(yè)違規(guī)加入兒童類化妝品或是宣稱具有舒緩、修護功效化妝品中的風險。但查閱相關(guān)文獻，目前尚未有可以檢測化妝中迪高替尼等4種組分的方法，使此類風險的監(jiān)管尚處于空白，給消費者用妝安全帶來隱患。筆者建立了可快速、高效地在化妝品中同時檢測迪高替尼、托法替尼、烏帕替尼、魯索替尼4種組分的高效液相色譜檢測法。

 

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：島津LC-20AD型，配有SIL-20AC自動進樣器、DGU-20 A在線真空脫氣機、CTO-20A柱溫箱、SPD-M40二極管陣列檢測器，日本島津儀器公司。

電子分析天平：METTLER TOLEDO XS205DU型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

渦旋震蕩器：IKA MS3型，德國愛卡公司。

超聲波清洗儀：PRIMA PM5-2000TD型，英國普律瑪儀器公司。

離心機：賽默飛X1R型，美國賽默飛世爾科技公司。

超純水發(fā)生器：Millipore Milli Q Reference型，美國密理博公司。

迪高替尼、托法替尼、魯索替尼標準品：純度(質(zhì)量分數(shù))分別為99.9%、98.3%、99.9%，上海安譜實驗科技股份有限公司。

烏帕替尼標準品：純度(質(zhì)量分數(shù))為99%，上海麥克林生化科技股份有限公司。

甲醇：色譜純，德國默克公司。

1.2 溶液配制

標準儲備溶液：分別精密稱取迪高替尼、托法替尼、烏帕替尼、魯索替尼4種標準品約0.01 g (精確至0.000 1 g)于4只10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標線，搖勻，于-4 ℃下保存。

混合標準溶液：分別精密移取4種標準儲備溶液各1 mL于同一10 mL容量瓶中，用80%(體積分數(shù)，下同)甲醇溶液稀釋至標線，得4種標準品質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的混合標準溶液。

系列混合標準工作溶液：精密移取一定量的4種組分的混合標準溶液，用80%甲醇溶液逐級稀釋，得到4種組分質(zhì)量濃度均分別為0.5、1、2、5、10、25、50 μg/mL的系列混合標準工作溶液。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK TYPE MG柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm，廠家)；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL；檢測波長：225 nm；流動相：A相為水，B相為甲醇；流量：1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫條件見表1。

表1   梯度洗脫條件

Tab. 1   Gradient elution program

 

1.4 樣品處理

精密稱取0.5 g樣品(精確至0.000 1 g)于10 mL具塞比色管中，加入80%甲醇溶液8 mL，用渦旋震蕩器混勻，超聲提取20 min，后用80%甲醇溶液定容至10 mL，必要時于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液作為樣品溶液。

1.5 樣品測定

在1.3液相色譜條件下，取系列混合標準工作溶液分別進樣，進行色譜分析，以系列混合標準工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。取樣品溶液進樣，測得色譜峰面積，根據(jù)標準工作曲線得到樣品溶液中迪高替尼等4種組分的質(zhì)量濃度。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

比較了水-乙腈和水-甲醇為流動相[15]時4種組分的分離效果，結(jié)果表明，兩種流動相體系下4種組分均能有效分離且色譜峰形較好，但水-乙腈體系下保留時間較短，不利于后期樣品檢測，水-甲醇體系下保留時間合適且分離度好，故選擇水-甲醇作為流動相體系。甲醇作為有機相時，分別試驗了10、20 mmol/L乙酸銨緩沖鹽溶液對4種組分分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水-甲醇體系下各組分峰形已經(jīng)較好，添加緩沖鹽并未使峰形更好。綜上所述，選擇水-甲醇作為流動相。

2.2 色譜柱溫度的選擇

比較柱溫分別為25、30、35、40 ℃時4種組分的分離效果。結(jié)果顯示，4種柱溫條件下4種組分均能得到有效分離，但隨著柱溫降低保留時間有所延長，綜合考慮，選擇柱溫為40 ℃。

2.3 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對4種組分進行全波長掃描，掃描范圍為190～400 nm，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，迪高替尼在284 nm波長處有最大吸收，托法替尼在286 nm波長處有最大吸收，烏帕替尼在232 nm、340 nm處有最大吸收，魯索替尼在252 nm、310 nm處有最大吸收，4種組分在短波長區(qū)域都有較大的紫外吸收，為了方便試驗操作，統(tǒng)籌考慮，選擇225 nm作為迪高替尼、托法替尼、烏帕替尼、魯索替尼等4種組分的檢測波長。

1—迪高替尼；2—托法替尼；　3—烏帕替尼；　4—魯索替尼圖1　

4種組分的紫外吸收光譜圖

Fig. 1   UV absorption spectrum of 4 components

2.4 提取溶劑的選擇

根據(jù)前述流動相的種類以及4種組分均較易溶于甲醇的特性，考察了不同體積分數(shù)(100%、80%、60%、40%)甲醇溶液作為提取溶劑時樣品的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當甲醇體積分數(shù)為40%時，4種組分的提取回收率較低，為65%～80%；隨著甲醇體積分數(shù)的增加，4種組分的提取回收率均有不同程度的增加，當甲醇體積分數(shù)為80%和100%時，4種組分的提取回收率無明顯差異。綜合考慮，采用體積分數(shù)為80%的甲醇溶液作為提取溶劑。

2.5 專屬性試驗

按1.3條件分別測定迪高替尼等4種組分混合標準溶液、空白樣品溶液、加標樣品溶液，色譜圖分別見圖2～圖4。由圖可見，4種組分峰形和分離度均表現(xiàn)良好，樣品溶液基質(zhì)對4種組分的測定無干擾，加標樣品溶液與混合標準溶液中4種組分的保留時間一致，表明該方法具有良好的專屬性。

 1—迪高替尼；2—托法替尼；　3—烏帕替尼；　4—魯索替尼

圖2　混合標準溶液色譜圖

Fig. 2   Chromatograms of mixed standard solution

 1—迪高替尼；2—托法替尼；　3—烏帕替尼；　4—魯索替尼

圖4　加標樣品溶液色譜圖

Fig. 4   Chromatograms of spiked sample solution

圖3   空白樣品溶液色譜圖

Fig. 3   Chromatograms of blank sample solution

2.6 線性回歸方程

取系列混合標準工作溶液在1.3液相色譜條件下進行測定，以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標，對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到回歸方程。4種組分在對應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，結(jié)果如表2所示。

表2   4種組分的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

Tab. 2   Linear range，linear equation and correlation coefficient of 4 components

 

2.7 檢出限和定量限

取較低質(zhì)量濃度的混合標準工作溶液，稀釋進樣，記錄信噪比(S/N)，按S/N為3和10的標準，計算檢出限和定量限，結(jié)果如表3所示。

表3   4種組分的檢出限、定量限

Tab. 3   Detection limit and quantification limit of 4 components

 

2.8 樣品加標回收試驗

選取霜類、乳液類、水劑類3類化妝品常見劑型進行加標回收試驗。稱取3類空白樣品各0.5 g，分別加入50、100、500 μL混合標準溶液，制得低、中、高3個濃度水平的加標樣品，每個濃度水平平行制備6份，按1.4樣品處理進行操作，得到樣品溶液并測得其中的迪高替尼等4種組分的質(zhì)量濃度，計算各組分回收率和測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表4。4種組分在3類基質(zhì)下的平均回收率為92.6%～100.6%，RSD為0.2%～4.1%(n=6)。結(jié)果表明，該方法在霜類、乳液類、水劑類3類基質(zhì)中的準確度和精密度均良好。

表4   樣品加標回收試驗結(jié)果

Tab. 4   Results of recovery test of spiked samples

 

3 結(jié)語

建立了同時測定迪高替尼等4種治療特應(yīng)性皮炎組分的高效液相色譜法，該方法操作簡單，標準曲線線性關(guān)系、準確度和精密度良好，為檢測化妝品中迪高替尼、托法替尼、烏帕替尼、魯索替尼等治療特應(yīng)性皮炎藥物提供了新的方法。該方法的建立有效補充了化妝品非法添加的檢測范圍，為監(jiān)管部門的科學監(jiān)管監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

 

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