本文綜合整理國(guó)內(nèi)外制藥用生物原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，選取典型微生物污染、化學(xué)污染、寄生蟲(chóng)污染檢測(cè)技術(shù)作為代表，對(duì)制藥用生物原材料檢測(cè)技術(shù)展開(kāi)綜述，結(jié)合現(xiàn)階段中國(guó)生物制藥的實(shí)際情況，闡述制藥用生物原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)，以期為制藥用生物原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定及檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用提供有益借鑒。
生物原材料作為食品藥品生產(chǎn)的關(guān)鍵成分，其質(zhì)量直接關(guān)系到食品藥品的安全性。近年來(lái)，食品藥品安全事件頻發(fā)，人畜共患病呈增多趨勢(shì)。相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球已知的人畜共患病超過(guò)200種。因此，生物原材料的質(zhì)量逐漸受到世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。中國(guó)地域遼闊，自然資源與生物資源豐富，為制藥用生物原材料提供了極為豐富的來(lái)源。然而，就當(dāng)前情況而言，我國(guó)在制藥用生物原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)技術(shù)方面尚未達(dá)到成熟階段，仍需進(jìn)一步優(yōu)化與調(diào)整。
Part.01國(guó)內(nèi)外制藥用生物原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
制藥用生物原材料來(lái)源廣泛，包括動(dòng)植物和微生物等多種生物資源。影響制藥用生物原材料安全的主要因素有微生物污染、化學(xué)物質(zhì)殘留及寄生蟲(chóng)感染，這些也是生物原材料的主要污染源。各國(guó)藥典收錄并詳細(xì)規(guī)定了多種生物原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法，成為檢驗(yàn)食品、藥品及生物原材料質(zhì)量的重要依據(jù)。
1.1國(guó)外制藥用生物原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
歐美、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)在制藥用生物原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)技術(shù)方面取得了顯著成就。這些國(guó)家的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)覆蓋范圍廣泛，檢測(cè)技術(shù)極為先進(jìn)，檢測(cè)精度可達(dá)十億分之一。
《美國(guó)藥典》（United States Pharmacopeia,USP）由非營(yíng)利組織主持編制，通過(guò)建立國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)來(lái)保障人用和獸用藥品的質(zhì)量與使用安全。USP制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration,FDA）及35個(gè)國(guó)家強(qiáng)制實(shí)施，是國(guó)際公認(rèn)的制藥用生物原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。USP包含3700多篇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)專(zhuān)論，并提供1600多個(gè)主要化學(xué)參考標(biāo)準(zhǔn)。這些標(biāo)準(zhǔn)要求在美國(guó)范圍內(nèi)嚴(yán)格執(zhí)行藥品生物原材料的檢驗(yàn)工作。
《歐洲藥典》（European Pharma?copoeia,EP）以嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范性著稱(chēng)。EP第4版收錄了1750種特定生物原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并配有相應(yīng)的圖譜和色譜分析資料。在制藥用生物原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面，歐洲藥品質(zhì)量管理局出具了適用性證書(shū)，以證明生物原材料制造商生產(chǎn)的產(chǎn)品符合EP要求。《英國(guó)藥典》（British Pharmacopoeia,BP）是英國(guó)官方認(rèn)證的醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)合集，是英國(guó)制藥標(biāo)準(zhǔn)制定的主要依據(jù)。BP中涵蓋大量?jī)r(jià)值不菲的醫(yī)學(xué)專(zhuān)著，其中不僅包含生物原材料的質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，還包含成藥的配方標(biāo)準(zhǔn)、公式配藥標(biāo)準(zhǔn)等。
1.2國(guó)內(nèi)制藥用生物原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《藥典》）由中國(guó)醫(yī)藥科技出版社出版，是規(guī)范全國(guó)藥物質(zhì)量管理的重要標(biāo)準(zhǔn)?！端幍洹窂?qiáng)制規(guī)定了藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法，是藥品生產(chǎn)、流通、使用、監(jiān)督管理的法律依據(jù)?，F(xiàn)行2020年版《藥典》共分為四部，分別為中藥、化學(xué)藥、生物制品、通則和藥物輔料，收錄了大量中藥品、化學(xué)藥品的生物原材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是中國(guó)各類(lèi)生物制藥企業(yè)生產(chǎn)藥品時(shí)必須遵循的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。
目前，國(guó)內(nèi)外藥典均規(guī)定要對(duì)藥用生物原料中的致病性微生物進(jìn)行檢驗(yàn)。常見(jiàn)檢測(cè)對(duì)象包括大腸埃希菌、大腸菌群、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌等。USP、BP、EP等權(quán)威藥典在微生物限度檢查方面呈現(xiàn)出檢測(cè)菌種不斷增加的趨勢(shì)。美國(guó)自第19版藥典發(fā)布以來(lái)，微生物限度檢查項(xiàng)目已從35種增至USP第24版的217種，其中包括13種動(dòng)物來(lái)源的生物原料。BP(1998版）和EP(1997版）則收錄了43種微生物限度檢查項(xiàng)目，其中4種為動(dòng)物源性品種。在EP中，除了常用的薄層色譜法、高效液相色譜法及雜質(zhì)對(duì)照品外，一些生物原料還列出了一些可能存在的雜質(zhì)及化合物的結(jié)構(gòu)式，其中還會(huì)列出一些化合物圖譜。
Part.02典型微生物污染、化學(xué)污染和寄生蟲(chóng)污染檢測(cè)技術(shù)
2.1微生物污染監(jiān)測(cè)技術(shù)
2.1.1 禽流感病毒檢測(cè)
目前，國(guó)內(nèi)外禽流感病毒診斷技術(shù)已較為成熟，主要包括雞胚接種法、核酸序列恒溫?cái)U(kuò)增（NASBA）技術(shù)、熒光實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timeRT-PCR）和基因擴(kuò)增技術(shù)等。其中，雞胚接種法因操作煩瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)且成本高等弊端，在臨床上應(yīng)用較少。NASBA技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)效率高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于禽流感病毒的快速檢測(cè)，不僅能夠準(zhǔn)確區(qū)分致病性和非致病性禽流感病毒，還不受其他因素干擾。現(xiàn)階段，我國(guó)已建立用于禽流感H5、H7、H9三個(gè)亞型毒株的復(fù)合熒光PCR技術(shù)。此外，基于熒光PCR的新型檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)新城雞瘟病毒的實(shí)時(shí)定量PCR快速測(cè)定。日本國(guó)家傳染病研究中心與榮研化工株式會(huì)社合作研發(fā)的快速檢測(cè)技術(shù)，可以在30 min內(nèi)對(duì)含有H5亞型的H5N1進(jìn)行識(shí)別，極大地縮短了對(duì)禽流感病毒的分析時(shí)間，提高了檢測(cè)精度。
2.1.2 大腸桿菌O157:H7檢測(cè)
大腸桿菌O157:H7有4種常用的檢測(cè)方法。
1）金標(biāo)試紙法：對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理和消毒后，向反應(yīng)區(qū)添加一定數(shù)量的金標(biāo)顆粒進(jìn)行檢測(cè)。該方法操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速，且已得到廣泛應(yīng)用。
2)ISO-GRID法：先用不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾樣本，然后將其置于特制的瓊脂平板上，使用薄膜法進(jìn)行測(cè)定。該方法檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好。
3）酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)：該方法基于專(zhuān)用儀器的ELISA分析，結(jié)合常規(guī)菌群分離和生化分析，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)病原菌，是微生物分析領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。
4)PCR技術(shù)：該技術(shù)具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、消耗少、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)。
2.1.3 口蹄疫病毒檢測(cè)
口蹄疫病毒檢測(cè)方法主要有RT-PCR、基因工程改造細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)等。RT-PCR檢測(cè)方法具有特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、快速等優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)被測(cè)樣品要求不高，可以實(shí)現(xiàn)全過(guò)程自動(dòng)化檢測(cè)。美國(guó)麻省理工學(xué)院的托德·賴(lài)德用水母中的熒光細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞進(jìn)行修飾，使其在30 s內(nèi)即可檢測(cè)出口蹄疫病毒，但這種檢測(cè)方法對(duì)技術(shù)要求較高且成本較高，尚未完全推廣使用。
2.2化學(xué)污染檢測(cè)技術(shù)
2.2.1 鹽酸克倫特羅檢測(cè)
在國(guó)內(nèi)，對(duì)鹽酸克倫特羅（俗稱(chēng)“瘦肉精”）的檢測(cè)主要通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法篩選，經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用或高效液相色譜進(jìn)行驗(yàn)證，這種方法可以根據(jù)樣品的色澤變化迅速進(jìn)行定量分析，具有很高的特異性和靈敏度。
2.2.2 二噁英檢測(cè)
二噁英檢測(cè)主要包括化學(xué)儀器分析法、生物學(xué)檢測(cè)法。目前，公認(rèn)的二噁英類(lèi)物質(zhì)測(cè)定方法有美國(guó)EPA1613法、日本的JISK0311法、高分辨氣相色譜/低分辨質(zhì)譜（HRGC/LRMS）法等。這些方法具有高靈敏度、高選擇性和高特異性的特點(diǎn)，但存在樣品預(yù)處理煩瑣、分析周期較長(zhǎng)、費(fèi)用較高等問(wèn)題。GC/HRMS方法在確保高靈敏度的前提下簡(jiǎn)化了樣品的預(yù)處理過(guò)程，從而縮短了分析時(shí)間并降低了費(fèi)用，但是需要在專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。相比之下，HRGC/LRMS法雖能顯著降低檢測(cè)成本，但對(duì)于1 g樣品中二噁英含量（pg/g）的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性較差。
2.2.3 氯霉素殘留檢測(cè)
氯霉素殘留檢測(cè)的常用方法包括液相色譜法和氣相色譜法。其中，液相色譜法配備紫外檢測(cè)器，通過(guò)外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。而氣相色譜法則利用電子捕獲檢測(cè)器（ECD）對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量分析。
2.2寄生蟲(chóng)污染檢測(cè)技術(shù)
弓形蟲(chóng)病是一種全球性分布的人畜共患寄生蟲(chóng)病。目前主要有以下7種檢測(cè)方法：
1）直接鏡檢。采用瑞氏-姬氏（Giemsa-Wright）雙重染色法可檢出包涵體和包囊，但檢出率不完全，也可采用直接免疫熒光法。
2）動(dòng)物接種與組織培養(yǎng)法。將待檢體液或組織勻漿接種至小白鼠體內(nèi)或小鼠腎臟組織中進(jìn)行弓形蟲(chóng)的分離和鑒定。
3)DNA雜交技術(shù)。該方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高和檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)。
4）染色法。該方法可利用IgG抗體檢測(cè)弓形蟲(chóng)，但其不足之處在于需要活體動(dòng)物。
5）間接免疫熒光抗體試驗(yàn)。該方法具有速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，可以通過(guò)檢出IgG、IgM抗體完成弓形蟲(chóng)的快速檢測(cè)。
6）間接血凝試驗(yàn)。此法操作簡(jiǎn)單、符合率高，但重復(fù)性差，致敏紅細(xì)胞穩(wěn)定性差。
7）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。該方法能同時(shí)測(cè)定IgM、IgG等抗體，敏感性高、特異性強(qiáng)。目前，ELISA有多種衍生技術(shù)被廣泛應(yīng)用，如Golden A蛋白ELISA、辣根過(guò)氧化物酶切膠體金標(biāo)記、親和素-生物素ELISA、凝膠擴(kuò)散酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。
Part.03制藥用生物原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)
近年來(lái)，動(dòng)物源性制品的安全問(wèn)題日益受到重視。微生物污染、化學(xué)污染和寄生蟲(chóng)污染等均成為生物源性產(chǎn)品的重點(diǎn)檢測(cè)對(duì)象。全球許多國(guó)家正在加強(qiáng)對(duì)制藥用生物原材料的研究，并實(shí)施嚴(yán)格的管理和產(chǎn)品溯源措施。為保護(hù)自身利益并確保制藥效率與質(zhì)量，各國(guó)不斷研究更為先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以此來(lái)防止不合格產(chǎn)品進(jìn)入本國(guó)市場(chǎng)。作為生物資源大國(guó)，我國(guó)應(yīng)充分發(fā)揮資源優(yōu)勢(shì)，全面提升制藥用生物原料的質(zhì)量控制水平，加強(qiáng)制藥原料的檢驗(yàn)技術(shù)研發(fā)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)，以推動(dòng)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展。
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