內(nèi)毒素檢測(cè)在現(xiàn)代生物制品和醫(yī)藥領(lǐng)域中扮演著至關(guān)重要的角色，注射類藥物、注射器具，植入醫(yī)療器械等都有相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用以確保產(chǎn)品安全性。然而，在進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)的過程中，許多實(shí)驗(yàn)室和研究人員可能會(huì)面臨一系列挑戰(zhàn)和疑惑。
其中低內(nèi)毒素回收（LER）一直是備受關(guān)注的熱門話題，以下十個(gè)有關(guān)低內(nèi)毒素回收的問題你了解嗎？?jī)?nèi)毒素檢測(cè)專家Lonza為你解答。
Q：為何LER對(duì)生物制品生產(chǎn)非常重要？
A：法規(guī)要求生物制品需要通過兔熱原實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熱原含量以確保產(chǎn)品的安全性。如果能夠證明細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試于兔熱原等效，則可使用細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試代替兔熱原進(jìn)行檢測(cè)。需要注意的是，某些生物制品使用內(nèi)毒素檢查法檢測(cè)時(shí)會(huì)存在LER效應(yīng)，生產(chǎn)廠家需要使用兔熱原進(jìn)行檢測(cè)。
為了確認(rèn)LER是否和體內(nèi)的非內(nèi)毒素?zé)嵩粯赢a(chǎn)生致熱反應(yīng)，法規(guī)要求生物制品制造廠家進(jìn)行加標(biāo)（Hold-time） 研究，并且，相同時(shí)間點(diǎn)也需要進(jìn)行兔熱原檢測(cè)。
Q：FDA 對(duì)LER持什么樣的態(tài)度？
A：LER主要于生物制品有關(guān)，主要是與單克隆抗體及一些治療用融合抗體。加標(biāo)（Hold-time）研究表明LER不僅僅受到賦性劑的影響，蛋白濃度、內(nèi)毒素檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑的供應(yīng)商、Hold-time研究所用溫度及時(shí)間都是影響LER的主要因素。此外，角標(biāo)內(nèi)毒素的種類（RSE, CSE，NOE）也會(huì)影響最終結(jié)果。
Q：怎樣進(jìn)行Hold-time 研究？
A：
①向未稀釋樣品中加入一定濃度的內(nèi)毒素 (加標(biāo)內(nèi)毒素濃度≤樣品釋放限值)
②根據(jù)測(cè)試樣品信息確定hold-time研究參數(shù)（溫度，容器類型，考察時(shí)間點(diǎn)）
③在特定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)（例如：4小時(shí)，24小時(shí)，72小時(shí)，5天，7天）
④計(jì)算回收率
Q：FDA對(duì)于Hold-time 研究有哪些建議？
A：FDA對(duì)于Hold-time研究的建議總結(jié)如下：
①至少進(jìn)行3批產(chǎn)品的驗(yàn)證
②添加內(nèi)毒素濃度≤樣品的釋放限值
③對(duì)于產(chǎn)品的研究至少8天
④使用工作標(biāo)準(zhǔn)品作為最差條件進(jìn)行研究
Q：天然來源內(nèi)毒素（ Naturally Occurring Endotoxin ，NOE）和標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的區(qū)別？
A：天然來源的內(nèi)毒素（NOE）是從革蘭氏陰性菌中粗提出來的內(nèi)毒素。與RSE或者CSE 不同，天然來源的內(nèi)毒素（NOE）是不經(jīng)過純化的內(nèi)毒素。與RSE或者CSE 相比, NOE不容易導(dǎo)致LER，這可能與NOE為非精制提純內(nèi)毒素，含有蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片物有關(guān)。
Q：與RSE或者CSE相比，使用NOE 進(jìn)行研究是否有優(yōu)勢(shì)？
A：從提交給FDA的幾個(gè)BLA匯編數(shù)據(jù)來看（見表一），不論內(nèi)毒素來源如何，即不論使用CSE或者是NOE，細(xì)菌內(nèi)毒素測(cè)試和兔熱原檢測(cè)結(jié)果都存在沖突。這些數(shù)據(jù)從另外一方面表明，即使使用內(nèi)毒素檢測(cè)產(chǎn)生了LER現(xiàn)象，兔熱原檢測(cè)依然能夠檢測(cè)樣品是否會(huì)引起熱原反應(yīng)。這個(gè)因?yàn)檫@個(gè)原因，F(xiàn)DA 不支持或不鼓勵(lì)在Hold-time研究中使用NOE。此外，每種NOE從不同的菌種中制備并且菌種也會(huì)受到不同生長(zhǎng)條件影響。所以，如果沒有NOE的標(biāo)準(zhǔn)化制備流程，監(jiān)管機(jī)構(gòu)無法判斷NOE 是否能夠有效代替標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素。
表一：提交給FDA 的BLA數(shù)據(jù)摘要
目前有一些研究學(xué)者在Hold-time研究中使用了NOE，并且獲得了較好的結(jié)果。并且結(jié)果發(fā)表于2015年9月的美國藥典論壇，該論文的主要觀點(diǎn)為與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素相比NOE更加穩(wěn)定并且引起LER的可能性更小。然而，也有研究學(xué)者對(duì)此持反對(duì)意見。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，某些未稀釋樣品中添加的NOE或者CSE/RSE 不能回收回來。因此，關(guān)于NOE 能夠成功解決LER問題仍然未有定論。
Q：是否可以使用分散劑解決LER問題？
A：有一些樣品能夠使用分散劑，例如PyroSperse™來解決LER問題。然而，由于每個(gè)樣品出現(xiàn)LER問題的原因都不盡相同，所以分散劑并不能解決所有問題。當(dāng)出現(xiàn)LER問題時(shí)可以先使用分散劑如PyroSperse™來進(jìn)行摸索研究，如果分散劑不能解決問題，則需要探究其他樣品前處理方式。
Q：解決LER問題的樣品前處理方式有哪些？
A：解決LER問題的主要思路為去除遮蔽現(xiàn)象。主要處理方式包括：①調(diào)節(jié)pH，影響氫鍵②添加Mg2+/Ca2+，防止螯合劑螯合內(nèi)毒素聚合物中的二價(jià)離子③使用分散劑PyroSperse™，干擾內(nèi)毒素聚集
Q：LER是否有潛在公共安全性問題？
A：FDA對(duì)于LER及其與藥物安全性的相關(guān)性問題持保守謹(jǐn)慎態(tài)度。盡管目前沒有報(bào)道表明LER有公共安全問題，但是FDA擔(dān)心某些藥物會(huì)因?yàn)長(zhǎng)ER問題不能通過USP<85>檢出內(nèi)毒素，從而引起人體熱原反應(yīng)。
Q：有哪些組織正在幫助醫(yī)藥生產(chǎn)商研究LER問題？
A：PDA （Parenteral Drug Association）以及BPOG （Biophorum Operations Group）均成立LER研究工作組，用于研究LER的影響以及解決LER問題的方案。試劑供應(yīng)商、內(nèi)毒素檢測(cè)終端用戶與全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)緊密合作，共同調(diào)查并給出受LER影響的產(chǎn)品的建議。
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