梔子柏皮湯始載于張仲景的《傷寒論》，由梔子、黃柏、甘草三味藥材組成，其具有泄熱利濕退黃的功效，是治療濕熱黃疸的經(jīng)典方劑。梔子柏皮湯不僅是退黃三方之一，還具有多種臨床療效，如通過(guò)干預(yù)機(jī)體炎癥、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫來(lái)治療肝炎和原發(fā)性肝癌。
指紋圖譜技術(shù)可以對(duì)中藥進(jìn)行整體性質(zhì)量控制，將復(fù)方中藥與藥材指紋圖譜譜峰進(jìn)行匹配，也常用于評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量。目前，針對(duì)梔子柏皮湯復(fù)方中藥相關(guān)研究主要集中在生物活性、化學(xué)成分、本草考證、提取工藝、含量測(cè)定、藥代動(dòng)力學(xué)等方面，而關(guān)于梔子柏皮湯復(fù)方中藥指紋圖譜研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
研究人員以梔子柏皮湯復(fù)方中藥為研究對(duì)象，建立其高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，指認(rèn)其特征峰，并與單味藥指紋圖譜進(jìn)行匹配，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）開(kāi)展相似度評(píng)價(jià)，以期為梔子柏皮湯的質(zhì)量控制、臨床用藥提供方法參考。
1試驗(yàn)方法
根據(jù)《傷寒論》，確定梔子柏皮湯的制備方法為：分別稱(chēng)取梔子10g、黃柏6g、甘草3g，置于1000mL燒杯中，加水400mL，浸泡30min，武火煎煮至沸騰后，調(diào)文火煎煮至250mL，依次用濾紙、0.45μm水相濾膜過(guò)濾，即得梔子柏皮湯供試品溶液，按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。同法分別配制單味藥材（梔子、黃柏、甘草）溶液。2結(jié)果與討論
2.1 分離條件的選擇
試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）對(duì)梔子柏皮湯供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，考察了不同流動(dòng)相體系 [0.2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）磷酸溶液-甲醇、0.2%磷酸溶液-乙腈、0.2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙酸溶液-甲醇、0.2%乙酸溶液 -乙腈、0.2%甲酸溶液-甲醇、0.2%甲酸溶液-乙腈 ]、柱溫（25，30，35℃）、色譜柱 [Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）、ODS-2-Hypersil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）、Syncronis C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）]等對(duì)梔子柏皮湯指紋圖譜色譜峰分離效果及出峰數(shù)量的影響。結(jié)果表明，試驗(yàn)選用 Diamonsil C18色譜柱、柱溫35℃時(shí)在 250nm波長(zhǎng)下以0.2%甲酸溶液-甲醇為流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫，得到的基線(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定，梔子柏皮湯15個(gè)共有峰分離效果較好。
2.2 梔子柏皮湯HPLC指紋圖譜的建立
取10批梔子柏皮湯處方藥材和各單味藥材，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行制備和分析，記錄色譜圖；取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。將色譜圖導(dǎo)入到中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版），以S1樣品色譜圖為參照指紋圖譜，采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R）。10批梔子柏皮湯和單味藥材的疊加指紋圖譜、對(duì)照指紋圖譜、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。
結(jié)果顯示，10 批梔子柏皮湯指紋圖譜共得到15個(gè)共有峰，其中8、11、13號(hào)峰歸屬于黃柏藥材的吸收峰，1~7、9、10、12、14、15號(hào)峰歸屬于梔子藥材的吸收峰，甘草藥材未產(chǎn)生15個(gè)共有峰中的吸收峰。在中醫(yī)處方中，甘草是最常用的一味中藥，常用于調(diào)和諸藥，被譽(yù)為“十二經(jīng)之使”，依據(jù)中醫(yī)藥配伍理論，甘草屬于“使藥”，在處方中主要起調(diào)好藥性作用，不作為質(zhì)量控制的關(guān)注點(diǎn)。
由于梔子柏皮湯由梔子、黃柏、甘草藥材組成，其中含有木蘭花堿、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、甘草苷、鹽酸小檗堿、甘草次酸、西紅花苷 -Ⅰ等化學(xué)成分，與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)d、9、10、e、13號(hào)峰分別為木蘭花堿、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、甘草苷、鹽酸小檗堿。由于部分批次峰面積較小或未檢測(cè)到d號(hào)峰和e號(hào)峰，因此沒(méi)有將d號(hào)峰和e號(hào)峰作為梔子柏皮湯指紋圖譜的共有峰，相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。
由于梔子苷峰的保留時(shí)間適中、峰面積最大，因此選擇10號(hào)峰為參照（S）峰。分別計(jì)算10批梔子柏皮湯指紋圖譜中其余14個(gè)共有峰與參照峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的結(jié)果（n=10）
結(jié)果顯示：14個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.017%~0.89%，說(shuō)明儀器穩(wěn)定性較高；14個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積的RSD為20%~70%，說(shuō)明梔子柏皮湯在臨床用藥時(shí)，可能受處方藥材產(chǎn)地、采收期、提取溫度等因素影響，各批次梔子柏皮湯共有峰差異性較大，相對(duì)峰面積的RSD呈現(xiàn)一定的波動(dòng)性。
2.3 相似度評(píng)價(jià)
采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果
結(jié)果顯示，10批梔子柏皮湯指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.880~0.949，表明不同批次間總體差異性較小，但由于受藥材產(chǎn)地、采收期等因素的影響，梔子柏皮湯的化學(xué)質(zhì)量存在一定的差異性。
2.4 方法學(xué)驗(yàn)證
2.4.1 精密度試驗(yàn)
取梔子柏皮湯處方藥材S1，按照試驗(yàn)方法制備供試品溶液，并按照儀器工作條件連續(xù)進(jìn)樣6針，以10號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果顯示，梔子柏皮湯各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.30%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.8%，表明儀器精密度良好，符合檢測(cè)要求。
2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)
取梔子柏皮湯處方藥材S1共6份，按試驗(yàn)方法制備6份供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，以10號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果顯示，梔子柏皮湯各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.060%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。
2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取梔子柏皮湯處方藥材S1，按照試驗(yàn)方法制備供試品溶液，于室溫放置 0，2，4，6，12，24h后按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，以10號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果顯示，梔子柏皮湯各個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在室溫放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
3試驗(yàn)結(jié)論
研究人員建立了梔子柏皮湯的HPLC指紋圖譜，確定了15個(gè)共有峰，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明梔子柏皮湯質(zhì)量整體穩(wěn)定；與對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)9、10、13號(hào)峰分別為京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、鹽酸小檗堿。該方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便，可為梔子柏皮湯的質(zhì)量控制、臨床用藥及后期新藥研發(fā)提供參考與方法借鑒。
作者：李燕1，滕樂(lè)1，唐軍相1，張德慶1，李陽(yáng)2，韓忠耀1
單位：1. 黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校；2. 駐馬店市中心醫(yī)院。
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