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摘要

建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）測(cè)定鹽酸氟桂利嗪膠囊中潛在基因毒性雜質(zhì)氟桂利嗪雜質(zhì)8。采用Agilent Poroshell120EC C18色譜柱（3.0mm×50mm，2.7µm），乙腈-10mmol/L乙酸銨梯度洗脫，流速0.3mL/min，柱溫30℃；電噴霧正離子模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)果表明，空白溶劑對(duì)氟桂利嗪雜質(zhì)8檢測(cè)無(wú)干擾，3~150ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好（r=0.999）。加標(biāo)回收率85.1%~93.7%，RSD為3.4%，精密度良好，定量限8pg/mL，檢測(cè)限2pg/mL。采用TTC法對(duì)34批不同處方的樣品進(jìn)行檢測(cè)，均符合規(guī)定。本方法靈敏、準(zhǔn)確，適用于鹽酸氟桂利嗪膠囊中基因毒性雜質(zhì)8的質(zhì)量控制，但需關(guān)注其同分異構(gòu)體的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞

基因毒性雜質(zhì)；氟桂利嗪雜質(zhì)8；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；TTC法；同分異構(gòu)體

鹽酸氟桂利嗪為一種選擇性鈣拮抗劑，是唯一能夠通過(guò)血腦屏障發(fā)揮作用的鈣離子拮抗劑?？筛纳颇X微循環(huán)及神經(jīng)元代謝，抑制腦血管痙攣、血小板凝聚及血液黏滯度增高等，主要用于典型（有先兆）或非典型（無(wú)先兆）偏頭痛的預(yù)防性治療及由前庭功能紊亂引起的眩暈的對(duì)癥治療[1-3]。常見(jiàn)的不良反應(yīng)為嗜睡、疲乏、抑郁、上腹痛、體重增加（食欲增加）、肌肉疼痛等，少部分人會(huì)出現(xiàn)不自主運(yùn)動(dòng)、下頜運(yùn)動(dòng)障礙、強(qiáng)直等椎體外系癥狀[4-6]。

根據(jù)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，鹽酸氟桂利嗪可能存在潛在基因毒性雜質(zhì)4-[雙（4-氟苯基）甲基]-1-[（3-苯基環(huán)氧乙烷-2-基）甲基]哌嗪-1-氧化物（命名：氟桂利嗪雜質(zhì)8），化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，為鹽酸氟桂利嗪在一定反應(yīng)條件下被空氣中的氧氣氧化產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物。經(jīng)ADMET Predictor軟件預(yù)測(cè)，該雜質(zhì)具有基因毒性?；蚨拘噪s質(zhì)（Genotoxic Impurities，GTIs）可通過(guò)與DNA直接作用，引發(fā)堿基錯(cuò)配、斷裂或染色體畸變，導(dǎo)致基因突變或癌癥風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，在極低濃度下即可造成不可逆的DNA損傷，氟桂利嗪雜質(zhì)8含環(huán)氧丙烷結(jié)構(gòu)，可能通過(guò)烷基化作用損傷DNA。ICH M7、EMA等指南要求對(duì)潛在基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與控制，基因毒性雜質(zhì)通常需控制至ppm甚至ppb級(jí)，因此需建立高靈敏度分析方法（如HPLC-MS/MS、GC-MS/MS）對(duì)該類雜質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確保藥物安全。

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)，建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，可用于快速檢測(cè)鹽酸氟桂利嗪膠囊可能存在的氟桂利嗪雜質(zhì)8，為藥品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐[7-15]。

1儀器與試藥

1.1 儀器

AB Sciex5500三重四極桿質(zhì)譜儀，上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司；XP205電子天平，精度0.01mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試藥

氟桂利嗪雜質(zhì)8對(duì)照品（批號(hào)：25-SEP-23-08，純度：94.94%），QUALITY CONTROL CHEMICALS INC；34批不同企業(yè)不同處方的鹽酸氟桂利嗪膠囊樣品；甲醇、乙腈（色譜純，4L），默克；甲酸銨（色譜純，100g），科密歐。

2方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

Agilent Poroshell120EC C18色譜柱（3.0mm×50mm，2.7µm）；以乙腈為流動(dòng)相A，以10mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相B，照表1進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.3mL/min；柱溫：30℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器，電噴霧正離子模式（ESI+），進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），氣簾氣壓力為30psi，噴撞氣為9psi，離子化電壓5500V，干燥氣溫度500℃，噴霧氣壓力為50psi；輔助加熱氣壓力為50psi。MRM參數(shù)見(jiàn)表2所示。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液

取本品內(nèi)容物研磨成細(xì)粉，精密稱取適量（約相當(dāng)于鹽酸氟桂利嗪20mg），置10mL量瓶中，加甲醇適量使溶解，渦旋5min，振搖10min，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，既得。

2.2.2 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液

取氟桂利嗪雜質(zhì)8對(duì)照品，用甲醇配制成為濃度分別為3、7.5、20、50、75、100、150ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取空白溶液（甲醇）、標(biāo)準(zhǔn)溶液（75ng/mL）、供試品溶液分別注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，照2.1色譜與質(zhì)譜條件檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果表明，空白溶劑在目標(biāo)峰位置不出峰，不干擾氟桂利嗪雜質(zhì)8的測(cè)定。在該條件下，標(biāo)準(zhǔn)溶液在7.5min和7.7min出現(xiàn)兩個(gè)峰且存在動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化，推測(cè)該雜質(zhì)存在同分異構(gòu)體。設(shè)定Scan Type模式掃描Product Ion（MS2），通過(guò)提取離子流色譜圖，發(fā)現(xiàn)僅7.5min峰存在133.1的碎片離子，推測(cè)雜質(zhì)8存在如圖2結(jié)構(gòu)的三元氧環(huán)開(kāi)裂后的同分異構(gòu)體（氟桂利嗪雜質(zhì)9）。因標(biāo)準(zhǔn)溶液兩個(gè)峰存在轉(zhuǎn)化但總峰面積相對(duì)穩(wěn)定，以兩峰之和計(jì)算相應(yīng)結(jié)果。

2.4 線性和范圍

取氟桂利嗪雜質(zhì)8系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，照2.1色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。氟桂利嗪雜質(zhì)8在3.0076~150.38ng/mL濃度范圍內(nèi)線性回歸方程為y=90037x-114196，r=0.999，線性關(guān)系良好，符合痕量分析要求。

2.5 定量限和檢測(cè)限

取氟桂利嗪雜質(zhì)8系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（1）逐步稀釋，照2.1色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，按S/N=10折算定量限為8pg/mL，按S/N=3折算檢測(cè)限為2pg/mL，滿足基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)需求。

2.6 回收率試驗(yàn)

回收率溶液的制備：取鹽酸氟桂利嗪膠囊20粒，精密稱定總重，傾出內(nèi)容物，研細(xì)混勻，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于鹽酸氟桂利嗪20mg），置10mL量瓶中，分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000µg/mL）0.75mL、1.50mL、2.25mL，平行制備各3份，加甲醇適量使溶解，渦旋5min，振搖10min，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為低、中、高濃度回收率溶液。照2.1色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，加樣回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。加標(biāo)回收率85.1%~93.7%，RSD為3.4%（n=9），符合ICH指南。

2.7 樣品的測(cè)定

對(duì)34批不同處方的樣品照2.2.1進(jìn)行供試品溶液的制備，照2.1色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，7.5min處的峰均未檢測(cè)到，7.7min處的峰均有檢出，以對(duì)照品兩峰之和計(jì)算，結(jié)果在1~11mg/kg之間，均低于75mg/kg（0.0075%）的限度，符合TTC法控制標(biāo)準(zhǔn)。

3討論

3.1 限度的確定

氟桂利嗪雜質(zhì)8有警示結(jié)構(gòu)，按TTC法控制，ICH M7指南指出，基于TTC計(jì)算可接受攝入量時(shí)，一個(gè)致突變雜質(zhì)每人每天攝入1.5µg時(shí)其風(fēng)險(xiǎn)被認(rèn)為是可以忽略的，基于毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）的限值計(jì)算需結(jié)合藥物日劑量與雜質(zhì)毒性數(shù)據(jù)，科學(xué)制定安全標(biāo)準(zhǔn)。鹽酸氟桂利嗪按照每日最大劑量20mg計(jì)算，氟桂利嗪雜質(zhì)8可接受濃度限值（mg/kg）=1.5µg/d/20mg/d×103=75mg/kg（0.0075%）。

3.2 測(cè)定結(jié)果分析

氟桂利嗪雜質(zhì)8分子中含環(huán)氧丙烷基團(tuán)，該結(jié)構(gòu)被ICH M7指南列為基因毒性警示結(jié)構(gòu)。通過(guò)考察，34批不同處方的樣品均未檢出該結(jié)構(gòu)雜質(zhì)，但均檢出其同分異構(gòu)體。此同分異構(gòu)體具體結(jié)構(gòu)以及是否具有基因毒性，有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

本研究建立的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，線性范圍、加標(biāo)回收率及精密度等均符合痕量分析要求，適用于鹽酸氟桂利嗪膠囊中潛在基因毒性雜質(zhì)氟桂利嗪雜質(zhì)8的質(zhì)量控制。后續(xù)需重點(diǎn)關(guān)注其同分異構(gòu)體的毒性及分離策略，以完善風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系。該方法亦可為含環(huán)氧丙烷類基因毒性雜質(zhì)藥物的質(zhì)量控制提供分析參考，助力解決痕量高危雜質(zhì)的檢測(cè)難題，推動(dòng)藥品質(zhì)量控制技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展。