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摘要

目的：研究肌苷片和肌苷口服溶液中的雜質。

方法：采用HPLC法測定肌苷片和肌苷口服溶液中的有關物質; 采用ADMET Predictor軟件預測和評價相關雜質的遺傳毒性。

結果：建立了肌苷的雜質譜，進行了雜質溯源，全面預測了肌苷、鳥苷、腺苷與次黃嘌呤的毒理性質。

結論：通過LC-MS分析，明確了15個雜質中的鳥苷、腺苷與次黃嘌呤3個雜質; 肌苷、鳥苷和腺苷表現(xiàn)出大鼠的致癌性和一定的致突變性，次黃嘌呤表現(xiàn)出肝毒性，但4種雜質的整體毒性風險不大。

關鍵詞

肌苷; 次黃嘌呤; 鳥苷; 腺苷; 高效液相色譜法; 液質聯(lián)用法; 有關物質; 雜質; 毒性

肌苷為輔酶類藥物，是機體內ATP、輔酶A、核糖核酸及脫氧核糖核酸的組成部分，參與機體的物質代謝和能量代謝。用于急、慢性肝炎的輔助治療，不良反應較輕。國外藥典均未收載肌苷原料藥與制劑。2015年版《中國藥典》二部肌苷原料標準中，僅對有關物質總雜質進行了控制。肌苷片、肌苷口服溶液均未對有關物質進行控制。文獻明確報道的肌苷有關物質主要為次黃嘌呤[1-3]。經(jīng)函調與實地調研發(fā)現(xiàn): 原料藥均為發(fā)酵生產，中國擁有國內外最大的肌苷原料生產基地; 原料藥生產企業(yè)未對有關物質進行深入了解，制劑生產企業(yè)未研究該品種的有關物質情況。現(xiàn)建立了肌苷片與口服溶液中有關物質的測定方法; 建立了肌苷的雜質譜，通過LC-MS分析，明確了15個雜質中的鳥苷、腺苷與次黃嘌呤雜質，對雜質譜雜質進行了溯源分析，對不同來源的原料藥及不同生產企業(yè)的制劑雜質譜進行了研究與分析; 并采用ADMET Predictor軟件對肌苷、鳥苷、腺苷與次黃嘌呤進行了遺傳毒性的預測和評價?？蔀槿媪私鈬鴥燃≤掌图≤湛诜芤旱挠嘘P物質，進一步控制產品的質量提供參考。

1實驗部分

1.1 儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀(美國Agilent); Xevo TQ-S液質色譜儀(美國Waters)。肌苷、次黃嘌呤、鳥苷、腺苷等對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為140669-201606、140661-201704、111977-201501、110879-201703，純度分別為98.6%、100.0%、93.6%、99.7%); 原料藥、抽驗的211批片劑與23批口服溶液(市售); 甲醇為色譜純; 水為純化水。

1.2 方法與結果

1.2.1 溶液的制備

取適量樣品，用水溶解并稀釋制成0.5mg·mL-1的肌苷溶液，作為供試品溶液; 精密量取1mL，置100mL量瓶中，用水定容，作為對照溶液。

1.2.2 色譜條件、系統(tǒng)適用性試驗及方法學的驗證

采用HPLC法，填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相為甲醇-水(10∶90)，檢測波長248nm。精密量取供試品與對照溶液各10μL，分別進樣，記錄色譜圖至主峰保留時間的3倍。在此色譜條件下，空白輔料和空白溶劑無干擾; 肌苷、次黃嘌呤、鳥苷、腺苷的線性范圍分別為10.1900~6.3696×103、3.0100~6.0198×103、8.7200~5.4513×103、9.9500~6.2200×103ng·mL-1; r分別為0.9996、0.9996、0.9998、0.9999; 次黃嘌呤、鳥苷、腺苷相對肌苷的校正因子分別為0.62、0.96、1.13。肌苷、次黃嘌呤、鳥苷、腺苷的定量限分別為10.19、3.01、8.72、24.88ng·mL-1，檢測限分別為3.18、0.75、2.72、9.95ng·mL-1; 供試品溶液于常溫下放置12h穩(wěn)定[4]。鳥苷與腺苷的校正因子為0.9~1.1，可采用主成分的自身對照法計算含量; 次黃嘌呤的校正因子為0.62，按校正后的峰面積計算的含量比自身對照法小，加之次黃嘌呤在所有批次中的檢出量較小，故認為采用自身對照法也可控制次黃嘌呤的質量。

1.2.3 雜質譜的建立

按擬定的有關物質測定方法，檢測收集的原料藥、抽驗的211批片劑與23批口服溶液，共發(fā)現(xiàn)雜質15個(原料藥中6個、片劑中10個、口服溶液劑中14個)，雜質譜有一定重合。由于肌苷為發(fā)酵工藝生產，無法用分析合成藥物雜質的方式，如起始原料、中間體、副產物等進行雜質溯源。結合生產企業(yè)調研、文獻檢索信息、肌苷發(fā)酵生產工藝與肌苷有關物質研究，初步確定鳥苷、腺苷(原未知雜質8)與次黃嘌呤肌苷雜質，并通過LC-MS進行了確認(圖1)，這也是肌苷有關物質中鳥苷和腺苷的首次報道。

結合肌苷的生產工藝與文獻信息，分析3個已知雜質的來源: 鳥苷與腺苷同為肌苷工藝雜質，是枯草桿菌發(fā)酵的產物，其結構與肌苷均較為相似，發(fā)酵后提取、純化過程難以完全去除，其中，鳥苷為肌苷原料與制劑中的最大雜質; 次黃嘌呤是工藝雜質也是降解雜質，枯草桿菌發(fā)酵過程中的代謝產物，同時也是肌苷的水解產物，生產過程中主要在精制過程中的酸性環(huán)境下降解產生。其余雜質由于缺乏文獻資料，選取肇慶星湖肌苷原料藥一批，采用破壞實驗的方式，分析其降解產物，從而為確定有關物質中雜質來源提供依據(jù)。文獻檢索及生產調研中發(fā)現(xiàn)，肌苷對酸、堿、高溫及高濕敏感，易水解，故選擇0.5mg·mL-1的肌苷溶液在高溫(75℃水浴1h)、光照(4.5×103Lx的日光燈下照射24h)、酸(60℃，2.5mL0.1mol·L-1鹽酸，1h)、堿(60℃，2.5mL 0.1mol·L-1氫氧化鈉溶液，1h)及氧化(2mL3%H2O2，1h)等條件進行破壞試驗，分析雜質的成因及歸屬。結果表明: 樣品對熱與光照相對穩(wěn)定; 對堿與氧化穩(wěn)定性次之; 在高溫條件下對酸不穩(wěn)定，肌苷降解顯著，主要降解產物為次黃嘌呤，各條件下所產生的降解產物在該色譜條件下能與主峰有效分離。綜合生產企業(yè)調研、文獻檢索信息，破壞實驗與原料藥與樣品檢測情況，分析雜質來源。結果鳥苷與腺苷均為肌苷工藝雜質，其中，鳥苷是原料藥與片劑的最大雜質，亦為口服溶液(除廣西南寧百會藥業(yè)外)的最大雜質; 次黃嘌呤為肌苷工藝雜質同時也是肌苷的水解產物，通過肌苷發(fā)生酸解而生成; 雜質1、2、4、6、7、9、11均為在堿性條件下可降解產生的雜質，其中，雜質6也可在氧化與光照條件下降解產生; 雜質3、6在口服溶液劑中檢出量較高，通過酸、堿、光、氧化、熱破壞等苛刻試驗發(fā)現(xiàn)，雜質3是氧破壞產物，雜質6可在氧化和光照情況下生成; 雜質5、10、12、13僅在制劑中有檢出，亦與原料藥降解產物無相關性，可能為制劑過程中產生的工藝雜質(表1)。

通過雜質溯源結果，再結合抽驗的211批片劑與23批口服溶液劑及不同生產廠家肌苷原料藥雜質檢出信息，整理出抽檢肌苷品種的雜質譜(圖2)。

1.2.4 雜質譜的分析

按擬定的有關物質測定法，考察了不同生產企業(yè)(肇慶星湖、濟南明鑫、新鄉(xiāng)制藥)原料藥中的有關物質(表2)。

不同生產企業(yè)的肌苷原料藥中雜質量差異較大，肇慶星湖的雜質量整體水平較低。調研企業(yè)時得知，其純化工藝中采用離子交換方式去除了大部分重結晶難以去除的雜質，提示該步驟可能為肌苷原料藥質控的關鍵步驟。對23個企業(yè)211批次的肌苷片和5個企業(yè)的23批次肌苷口服溶液，按“1.2.2”項方法進行分析。分析統(tǒng)計得到雜質在所檢樣品中的分布情況和各生產企業(yè)的產品檢出的雜質情況(圖3、圖4)。鳥苷是肌苷片和口服溶液的最大雜質，肌苷片和肌苷口服溶液的雜質檢出情況不太一樣，可能與制劑生產工藝有關。

1.2.5 雜質(遺傳)毒性的預測和評價

采用ADMET Predictor軟件對肌苷中3個雜質(鳥苷、腺苷和次黃嘌呤)的毒理性質參數(shù)做了全面的預測。鳥苷、腺苷和次黃嘌的呤吸收、代謝、毒理風險系數(shù)評分以及整體的ADMET成藥性打分結果見表3。

雖然肌苷、鳥苷和腺苷表現(xiàn)出大鼠的致癌性和一定的致突變性，次黃嘌呤表現(xiàn)出肝毒性，但4種雜質的整體毒性風險不大，其中，鳥苷的ADMET成藥性評分略高。鳥苷用量高于3.16mg·kg-1·d-1時可能產生不良反應，而肌苷片或口服溶液每日的最大使用劑量為1.8g，對于一個50kg的成年人來說，相當于每日肌苷的最大劑量為36mg·kg-1·d-1，故當鳥苷不超過8.7%時，都是安全的。結合肌苷、鳥苷、腺苷與次黃嘌呤的雜質毒性預測結果與此次抽樣樣品的檢驗情況，可認為樣品中有關物質控制總雜質量不得過1.0%時，可控制產品的質量。

2討論

參照肌苷原料藥的色譜條件考察此次抽驗品種有關物質時發(fā)現(xiàn): 現(xiàn)行方法雜質檢出率與各雜質的分離度均較好，但也存在一些問題: 進樣量為20μL時，不同品牌色譜柱均出現(xiàn)平頭峰、且色譜柱的壽命受影響，故將進樣量改為10μL，檢測靈敏度為供試品溶液濃度的0.002%; 肌苷原料與制劑的有關物質測定中，相對保留時間約為2.5處有雜質峰，故將“由記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍”修訂為“……3倍”。明確了鳥苷、腺苷與次黃嘌呤雜質，考察了鳥苷、腺苷與次黃嘌呤對肌苷的校正因子，并對擬定有關物質測定法進行了方法學驗證。在該色譜條件下，空白輔料和空白溶劑無干擾; 考察了5根不同品牌的色譜柱，不同品牌的色譜柱對測試結果的影響不大，方法的耐用性好。肌苷片和口服溶液目前沒有法定標準控制其有關物質，原料藥的方法也不足以發(fā)現(xiàn)所有的雜質(如腺苷)。