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摘要

目的：建立測定甲苯磺酸妥舒沙星中對甲苯磺酸甲酯（MTS）、對甲苯磺酸乙酯（ETS）和對甲苯磺酸異丙酯（IPTS）含量的氣相色譜質(zhì)譜法。

方法：色譜柱為HP-1MS（0.250mm×30m，0.50μm），程序升溫，進(jìn)樣口溫度為260℃。質(zhì)譜的電離方式為EI，電離電壓為70V，離子源溫度為250℃，采用正離子MRM掃描方式。對MTS、ETS和IPTS定量離子對分別為m/z91→65、m/z155→91和m/z91→65。

結(jié)果：48.779~975.59ng·mL-1MTS、54.586~1091.7ng·mL-1ETS、46.241~924.82ng·mL-1IPTS與峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r分別為0.9985、0.9984、0.9988。MTS、ETS和對IPTS平均回收率分別為99.47%、99.15%、98.83%（n=9）。7批樣品中對MTS、ETS和對IPTS均未檢出。

結(jié)論：所建立的方法可用于甲苯磺酸妥舒沙星中對MTS、ETS和對IPTS的含量測定。

關(guān)鍵詞

GC-MS-MS法；甲苯磺酸妥舒沙星；遺傳毒性雜質(zhì)；對甲苯磺酸甲酯；對甲苯磺酸乙酯；對甲苯磺酸異丙酯

甲苯磺酸妥舒沙星是廣譜抗菌藥，對支原體、需氧菌、厭氧菌和大腸埃希菌等多種菌均有抗菌效果，臨床上主要用于肺炎、支氣管炎等呼吸道感染，泌尿感染，結(jié)膜炎、角膜炎和中耳炎等五官科感染[1-4]。甲苯磺酸妥舒沙星為對甲苯磺酸與妥舒沙星形成的鹽，合成工藝過程中可能使用到試劑甲醇、乙醇和異丙醇進(jìn)行提取或純化，故存在對甲苯磺酸與甲醇、乙醇和異丙醇發(fā)生反應(yīng)生成烷基磺酸酯類物質(zhì)對甲苯磺酸甲酯（MTS）、對甲苯磺酸乙酯（ETS）和對甲苯磺酸異丙酯（IPTS）的風(fēng)險(xiǎn)。烷基磺酸酯類可與DNA發(fā)生烷基化反應(yīng)，可能引發(fā)癌癥，屬于遺傳毒性雜質(zhì)[5-7]。根據(jù)《中國藥典》2020年版中“遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則”以及美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）指南草案和歐洲醫(yī)藥評價(jià)署（EMEA）要求，必須對藥物或藥品中任何可能存在或未在早期合成步驟中予以清除的所有基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測[8]。烷基磺酸酯類基因毒性雜質(zhì)低劑量就可能引起毒性反應(yīng)，具有可接受限度值低的特點(diǎn)，對檢測方法靈敏度要求較高，目前文獻(xiàn)報(bào)道主要檢測方法為HPLC-MS法和GC-MS法[9-15]。本課題組根據(jù)樣品不需要進(jìn)行衍生化前處理的性質(zhì)特點(diǎn)，GC MS/MS法直接進(jìn)樣，并采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式監(jiān)測，以保證檢測方法的靈敏度。建立的方法能夠準(zhǔn)確測定甲苯磺酸妥舒沙星中MTS、ETS和IPTS的含量，為甲磺酸妥舒沙星的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent GC-MS-MS 8890-7010B三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）；電子分析天平為METTLER TOLEDO XP205、METTLER TOLEDO XSE205DU（瑞士梅特勒-托利多有限公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

甲苯磺酸妥舒沙星原料（批號190401、190701、191101、191201、200301、200501、200601；來源：天地恒一制藥股份有限公司）共7批次樣品，對甲苯磺酸甲酯（MACKU，批號為C13288825，純度為98%）、對甲苯磺酸乙酯（MACKU，批號為C1364164，純度為98%）、對甲苯磺酸異丙酯（MACKU，批號為C11462060，純度為95%）；水為超純水；N-N-二甲基甲酰胺（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為20211118）。

2方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用HP-1MS（30m×0.25mm，0.50μm）色譜柱，進(jìn)樣體積為1μL，進(jìn)樣口溫度為260℃，隔墊吹掃為3mL·min-1，分流比為10∶1，淬滅氣為4mL·min-1，碰撞氣為1.5mL·min-1，柱溫/程序升溫：50℃保持1min，以15℃升溫至230℃保持2min，柱流量1.5mL·min-1，恒流。傳輸線溫度為280℃，離子源（EI）為250℃，電子能量為70eV，增益因子為1，選擇離子監(jiān)測為MRM，質(zhì)譜MRM監(jiān)測離子信息見表1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶液（溶劑）N，N-二甲基甲酰胺。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品適量（約0.15g，批號為200301），精密稱定，精密加入5mL溶劑使溶解，作為供試品溶液。

2.2.3 混合對照品溶液的配制

分別精密稱取MTS18.79mg、ETS21.76mg和IPTS21.52mg，置同一100mL量瓶中，用溶劑溶解并稀釋刻度，搖勻，作為混合對照貯備液；精密量取混合對照貯備液適量，用溶劑進(jìn)行稀釋，配制成含MTS、ETS和IPTS濃度分別為93.95、108.8、107.6ng·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下3種溶液分別按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄氣相色譜-質(zhì)譜圖，結(jié)果總離子流色譜圖和離子提取圖中顯示空白溶劑均不干擾MTS、ETS和IPTS的測定。見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取MTS19.91mg，ETS22.28mg，IPTS19.47mg，用溶劑稀釋并配制成含MTS、ETS和IPTS濃度分別為9.955、11.14、19.735μg·mL-1的混合對照線性貯備液。分別精密量取混合對照線性貯備液0.5、1、2、4、5、10mL，分別置100mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，分別作為線性溶液。按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定線性溶液，以峰面積相對應(yīng)各成分濃度進(jìn)行線性回歸，得各成分的線性和范圍，結(jié)果見表2。

2.5 定量限和檢測限

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，用溶劑進(jìn)行稀釋，信噪比約為10: 1時(shí)，MTS、ETS和IPTS定量限分別為16.1、12.5、26.1ng·mL-1；信噪比約為3: 1時(shí)，MTS、ETS和IPTS檢測限分別為4.16、3.19、7.93ng·mL-1。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄氣相色譜質(zhì)譜圖。對MTS、ETS和IPTS響應(yīng)值RSD分別為5.48%、3.85%、6.66%，RSD均小于10%，表明該方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，在室溫放置0、1、2、4、5、6、7、8、12h，分別在取樣時(shí)間點(diǎn)，精密量取對照品溶液按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄氣相色譜-質(zhì)譜圖。在室溫條件下放置12h內(nèi)，MTS、ETS和IPTS響應(yīng)值RSD分別為9.79%、9.40%、9.77%，RSD均小于10%，表明該溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，同法制備供試品溶液6份，進(jìn)樣測定，記錄氣相色譜-質(zhì)譜圖，結(jié)果6份供試品溶液均未檢出MTS、ETS和IPTS。采用加樣回收法對重復(fù)性進(jìn)行評價(jià)，“2.9”項(xiàng)下MTS、ETS和IPTS回收率結(jié)果RSD分別為1.73%、2.46%、2.23%，均小于5%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照貯備液1、2.5、5mL，分別置100mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，分別作為低濃度貯備液、中濃度貯備液、高濃度貯備液。取供試品（約0.15g，批號為200301），精密稱定，分別精密量取低濃度貯備液、中濃度貯備液、高濃度貯備液各5mL，濾過，取續(xù)濾液，分別作為低濃度供試品溶液、中濃度供試品溶液、高濃度供試品溶液。分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果表明回收率均在92.46%~102.84%，該方法準(zhǔn)確可靠見表3。

3樣品測定及風(fēng)險(xiǎn)評估

采用擬建立的方法測定了天地恒一制藥股份有限公司生產(chǎn)的7批次甲苯磺酸妥舒沙星均未檢出對MTS、ETS和IPTS成分，結(jié)果表明該生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的甲苯磺酸妥舒沙星原料中存在磺酸酯類遺傳毒性雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)較低。

4討論

4.1 遺傳毒性及可接收限度

本試驗(yàn)采用遺傳毒性預(yù)測軟件ADMETPre dictor進(jìn)行預(yù)測，進(jìn)一步確認(rèn)對MTS、ETS和IPTS具有致突變性。根據(jù)ICH和《中國藥典》2020年版四部指導(dǎo)原則，可采用毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）計(jì)算可接受攝入量，TTC是從50%腫瘤發(fā)生率（TD50）的劑量簡單線性外推到百萬分之一發(fā)生率的劑量，在使用TTC作為評估原料藥和制劑中致突變性雜質(zhì)的可接受攝入量時(shí)，其對應(yīng)的理論上終生患癌風(fēng)險(xiǎn)為十萬分之一。給藥周期小于1月，TTC值為120μg·d-1；給藥周期1~12月，TTC值為20μg·d-1；給藥周期1~10年，TTC值為10μg·d-1；給藥周期終生長期（大于10年），TTC值為1.5μg·d-1；可接受限度等于TTC除以每日最大臨床劑量。甲苯磺酸妥舒沙星制劑給藥周期小于1月，TTC值為120μg·d-1，每日最大臨床劑量為2.4g，故甲苯磺酸妥舒沙星中對MTS、ETS和IPTS均可接受限度為0.005%。

4.2 色譜柱優(yōu)化

通過對3根不同極性填料的毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行色譜柱優(yōu)化，色譜柱分別是色譜柱VF-WAXms（30m×0.25mm，1μm）；色譜柱HP-5M（30m×0.25mm，1μm）、色譜柱HP-1MS（30m×0.25mm，0.50μm）。試驗(yàn)結(jié)果表明色譜柱①和色譜柱②分離效果差，色譜柱③能實(shí)現(xiàn)MTS、ETS和IPTS較好分離，且溶劑峰不會干擾待測成分的測定，最終選擇色譜柱③。

4.3 溶劑選擇

甲苯磺酸妥舒沙星在氫氧化鈉試液中微溶，在水或三氯甲烷中幾乎不溶，在N-N-二甲基甲酰胺或冰醋酸中易溶，故本試驗(yàn)選擇N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑。

4.4 質(zhì)譜定量離子的確定

本試驗(yàn)采用MRM監(jiān)測模式進(jìn)行測定，在確定性和定量離子對過程中，主要考慮MTS、ETS和IPTS特征碎片離子均小于m/z200且部分碎片離子相同，故本試驗(yàn)采用一個(gè)定量離子對和2個(gè)定性離子能夠更準(zhǔn)確地測定。MTS和IPTS離子保留時(shí)間不同，而m/z91→65離子對響應(yīng)較好，故MTS和IPTS均選擇m/z91→65離子對作為定量離子對。

4.5 方法學(xué)驗(yàn)證

本研究建立了甲苯磺酸妥舒沙星原料中對甲苯磺酸酯類化合物含量測定方法，專屬性好、線性范圍寬且線性關(guān)系良好，該方法靈敏準(zhǔn)確可靠，操作簡單，可以較好地滿足甲苯磺酸妥舒沙星原料中3種對甲苯磺酸酯類化合物的檢測，幫助企業(yè)進(jìn)行生產(chǎn)工藝控制以及為藥監(jiān)部門進(jìn)行監(jiān)管提供參考。