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40多年前，隨著重組人胰島素和人生長(zhǎng)激素的出現(xiàn)，生物藥物的研發(fā)開(kāi)始起步。當(dāng)時(shí)，這些藥物主要用于替代治療代謝或免疫疾病中涉及的天然蛋白質(zhì)，其在人體內(nèi)的循環(huán)半衰期僅為幾小時(shí)，這一較短的半衰期在最初被當(dāng)作生物學(xué)事實(shí)所接受。與傳統(tǒng)小分子藥物的藥代動(dòng)力學(xué)（吸收、分布、代謝和排泄，即ADME）相比，早年對(duì)蛋白質(zhì)或肽類(lèi)藥物快速消除的生物學(xué)機(jī)制的研究相當(dāng)有限。進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著嵌合和人源化抗體特別是曲妥珠單抗等抗體藥物的出現(xiàn)，它們具有長(zhǎng)半衰期，可達(dá)1-3周（在小鼠中為6-8天），使人們對(duì)長(zhǎng)半衰期生物藥的研發(fā)興趣大增。IgG及其融合蛋白的長(zhǎng)半衰期不僅源于其“大塊頭”，還歸因于FcRn介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)循環(huán)機(jī)制，其循環(huán)時(shí)間比細(xì)胞因子和其他小到中等大小的生物藥物長(zhǎng)幾個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，聚乙二醇化（PEGylation）技術(shù)的發(fā)展，為延長(zhǎng)傳統(tǒng)蛋白質(zhì)藥物的半衰期，減緩腎臟消除，提供了另外一種路徑。這些基本原理的廣泛認(rèn)可，激發(fā)了其他幾種延長(zhǎng)生物治療藥物半衰期的技術(shù)的發(fā)明。到目前為止，已有超過(guò)50種基于不同半衰期延長(zhǎng)技術(shù)（Fc融合、PEG化、白蛋白融合等）的藥物獲批，并有大量藥物處于臨床前和臨床不同研發(fā)階段。如下表所示，*代表已撤市。

本文擬對(duì)延長(zhǎng)生物藥物半衰期的策略進(jìn)行詳細(xì)介紹。

 

聚乙二醇化技術(shù)

 

聚乙二醇化是一種通過(guò)將藥物與合成的親水性高分子聚合物進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，以增加其水動(dòng)力學(xué)體積，從而減緩腎臟清除、延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間的技術(shù)。

 

該技術(shù)的基本概念最早可追溯到20世紀(jì)50年代。在早期研究中，肽胺類(lèi)藥物甘氨酰-L-亮氨酰-美斯卡林與血漿擴(kuò)容劑聚乙烯吡咯烷酮結(jié)合，以延長(zhǎng)其在體內(nèi)的停留時(shí)間，并實(shí)現(xiàn)藥物的緩慢酶催化釋放。盡管當(dāng)時(shí)也提出了將這種方法應(yīng)用于合成內(nèi)源性肽激素（如催產(chǎn)素或加壓素），但這一方法并未進(jìn)入臨床實(shí)踐。

 

20年后，在重組生物藥物出現(xiàn)之前，研究發(fā)現(xiàn)將甲氧基聚乙二醇與牛血清白蛋白和牛肝過(guò)氧化氫酶結(jié)合，可以降低動(dòng)物免疫反應(yīng)，延長(zhǎng)半衰期。這些研究的作者Frank Davis博士和他的博士生Abraham Abuchowski隨后創(chuàng)立了Enzon制藥公司，旨在將“聚乙二醇化”從實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。

 

Enzon公司首批獲得FDA批準(zhǔn)的產(chǎn)品是非人類(lèi)酶類(lèi)藥物：pegademase（Adagen®），一種聚乙二醇化的牛腺苷脫氨酶，用于酶替代療法，于1990年獲批；以及pegaspargase（Oncaspar®），一種聚乙二醇化的來(lái)自大腸桿菌的天冬酰胺酶（ASNase），用于治療對(duì)天冬酰胺酶天然制劑產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的急性淋巴細(xì)胞性白血?。ˋLL）患者，于1994年獲批。這兩款藥物均是通過(guò)表面賴(lài)氨酸殘基的ε-氨基基團(tuán)與多個(gè)5 kDa的聚乙二醇鏈進(jìn)行隨機(jī)結(jié)合，有效地屏蔽了人體免疫系統(tǒng)，從而減少了抗體反應(yīng)和蛋白降解，延緩了腎臟清除，使得pegademase可以每周給藥一次，而pegaspargase可以每?jī)芍芙o藥一次。

 

Enzon公司開(kāi)發(fā)的下一個(gè)產(chǎn)品是聚乙二醇化的重組干擾素α2b（IFNα2b）。通過(guò)將單個(gè)12 kDa的線(xiàn)性聚乙二醇以琥珀酰亞胺碳酸酯的形式與IFNα2b進(jìn)行化學(xué)結(jié)合，得到了藥物peginterferon alfa-2b（PegIntron®），該藥物于2000年獲得FDA批準(zhǔn)用于治療丙型肝炎。Peginterferon α2a（Pegasys®）采用了Shearwater技術(shù)，通過(guò)將分支的40 kDa N-羥基琥珀酰亞胺激活的聚乙二醇與干擾素α2a（IFNα2a）的賴(lài)氨酸側(cè)鏈結(jié)合，于一年后獲得FDA批準(zhǔn)用于相同適應(yīng)癥。

 

對(duì)這兩種聚乙二醇化干擾素版本的比較表明，連接化學(xué)和聚合物結(jié)構(gòu)都可以顯著影響PK和PD特性。Peginterferon alfa-2b在人體內(nèi)的血漿半衰期為27.2-39.3小時(shí)，而未修飾的IFN約為2小時(shí)，并作為異構(gòu)體混合物在體外保持了28%的活性。相比之下，peginterferon α2a的半衰期為61-110小時(shí)，但其在體外的活性已降至僅7%。Peginterferon alfa-2b從皮下注射部位迅速吸收（t1/2 = 4.6小時(shí)），而peginterferon α2a進(jìn)入血液的釋放顯著延遲（t1/2 = 50小時(shí)）。此外，peginterferon alfa-2b的生物分布與自然IFN相似（VD = 31-73小時(shí)），而peginterferon α2a的平均表觀(guān)分布容積減少到6-14 L，這很可能與更龐大的分支40 kDa聚乙二醇鏈有關(guān)。盡管如此，這兩種生物藥物在治療丙型肝炎方面都顯示出了療效，其中peginterferon α2a達(dá)到了更高的總體持續(xù)抗病毒反應(yīng)。

 

聚乙二醇化技術(shù)在早期成功應(yīng)用的基礎(chǔ)上，多年來(lái)不斷發(fā)展和完善。例如，在制備聚乙二醇化干擾素β-1a（Plegridy®）和聚乙二醇化粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF，商品名Neulasta®）時(shí)，采用了醛化學(xué)方法，在低pH條件下選擇性地將20 kDa的線(xiàn)性PEG鏈與N末端肽氨基基團(tuán)結(jié)合。而對(duì)于抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）Fab片段certolizumab pegol（Cimzia®），則通過(guò)工程化的未配對(duì)巰基基團(tuán)，使用馬來(lái)酰亞胺化學(xué)方法位點(diǎn)特異性地結(jié)合了分支的40 kDa PEG。這兩種方法都使得藥物制劑更加均一。

 

另一種實(shí)現(xiàn)PEG聚合物位點(diǎn)特異性結(jié)合的策略是通過(guò)引入非天然氨基酸。利用其專(zhuān)有的ReCODE™技術(shù)，Ambrx公司開(kāi)發(fā)了ARX201，這是一種重組人生長(zhǎng)激素（hGH），在35位通過(guò)琥珀終止密碼子抑制引入了單個(gè)對(duì)乙?；?L-苯丙氨酸殘基。然后將30 kDa的PEG鏈與其正交反應(yīng)基團(tuán)結(jié)合，得到了單一的聚乙二醇化hGH。與WHO的hGH標(biāo)準(zhǔn)相比，ARX201在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的生物活性?xún)H降低了約5倍，而在大鼠中的血漿半衰期增加了約9倍。然而，在2期臨床試驗(yàn)后，由于臨床前靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物研究表明PEG成分在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中累積，開(kāi)發(fā)被終止。

 

另一種聚乙二醇化hGH（PHA-794428）采用N末端結(jié)合40 kDa分支PEG，顯示出約20倍的受體親和力降低，但在每周給藥去垂體大鼠時(shí)，與每日給藥的hGH相比，誘導(dǎo)了相似的體重增加。該產(chǎn)品由于在2期臨床后期觀(guān)察到注射部位脂肪萎縮而終止開(kāi)發(fā)。最近，lonapegsomatropin（Skytrofa®），一種每周一次的聚乙二醇化hGH，獲得了FDA批準(zhǔn)。該分子是通過(guò)一個(gè)可自水解的所謂TransCon®連接子，將四臂PEG與hGH結(jié)合。除了由于其增加的水動(dòng)力學(xué)體積而具有更長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間外，這種修飾的hGH由于表面附著的雙分支PEG的空間干擾而沒(méi)有受體結(jié)合活性，從而也減少了受體介導(dǎo)的清除。然而，在血液pH和體溫下，PEG連接子會(huì)穩(wěn)定水解，導(dǎo)致生物活性激素的持續(xù)釋放。因此，在臨床開(kāi)發(fā)期間未觀(guān)察到注射部位的脂肪萎縮和PEG空泡化。同樣的聚乙二醇化技術(shù)最近被應(yīng)用于甲狀旁腺激素（PTH，1-34殘基）肽，以開(kāi)發(fā)長(zhǎng)效的palopegteriparatid（TransCon PTH），用于治療成人甲狀旁腺功能減退癥，并于2024年獲得FDA批準(zhǔn)，商品名為Yorvipath®。

 

為了減少黏度、進(jìn)一步改善藥代動(dòng)力學(xué)或規(guī)避免疫識(shí)別，已經(jīng)提出了幾種創(chuàng)新的PEG衍生物，例如由Holger Frey博士最近合成的一種結(jié)構(gòu)上“隨機(jī)化”的、多分支的PEG鏈。另一個(gè)例子是來(lái)自Polytherics（后來(lái)與Antitope合并，現(xiàn)為Abzena）的PolyPEG™技術(shù)。這種聚合物將PEG鏈連接到聚甲基丙烯酸酯主鏈的重復(fù)單元上，從而形成類(lèi)似梳子的結(jié)構(gòu)。與線(xiàn)性30 kDa PEG結(jié)合物相比，70 kDa PolyPEG與IFNα2a結(jié)合后的黏度約降低了3倍，在大鼠中的終末半衰期延長(zhǎng)了一倍。然而，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的效力比30 kDa PEG版本低約13倍，僅為天然IFN生物活性的0.5%。

 

聚乙二醇化技術(shù)的局限性主要體現(xiàn)在可能導(dǎo)致藥理學(xué)活性的降低，且?guī)?lái)一些安全性風(fēng)險(xiǎn)，比如注射部位脂肪萎縮和細(xì)胞質(zhì)空泡化等。還有一點(diǎn)需要注意，聚乙二醇化的最初想法是降低免疫原性，特別是對(duì)于非人類(lèi)來(lái)源的蛋白質(zhì)，但近年來(lái)越來(lái)越明顯的是，PEG本身可以觸發(fā)免疫反應(yīng)。這可能導(dǎo)致通過(guò)抗PEG抗體加速聚乙二醇化藥物的血漿清除，或激活補(bǔ)體系統(tǒng)。這點(diǎn)是在COVID-19大流行之后開(kāi)始受到關(guān)注，因?yàn)榇蠖鄶?shù)疫苗使用PEG屏蔽的脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）進(jìn)行mRNA遞送，并且報(bào)告了幾例與COVID-19 mRNA疫苗Corminaty®和Spikevax®接種相關(guān)的PEG相關(guān)過(guò)敏性反應(yīng)。事實(shí)上，PEG特異性抗體可以通過(guò)這種mRNA疫苗接種被誘導(dǎo)或增強(qiáng)，這可能會(huì)影響其他基于PEG的藥物的清除。

 

聚乙二醇的替代品

 

近年來(lái)，已有多種其他天然或化學(xué)合成的聚合物被提議作為PEG模擬物。這些大分子與PEG具有相似的生物物理特性，例如分子量大、在水性環(huán)境中溶解度高，且有望克服PEG的一些缺陷，如免疫原性和組織蓄積性。

 

其中一個(gè)例子是線(xiàn)性或超支化聚甘油（PG），它通過(guò)乙氧基乙基縮水甘油醚的陰離子開(kāi)環(huán)聚合獲得。一種40kDa的聚甘油與IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra，阿那白滯素）結(jié)合后，其半衰期與聚乙二醇化蛋白相似，且在動(dòng)物中表現(xiàn)出比聚乙二醇化更低的免疫原性和更長(zhǎng)的血漿半衰期。不過(guò)，聚甘油一般不能被體內(nèi)的內(nèi)源性酶降解。

 

聚肌氨酸可能是一種很有前景的可生物降解合成聚合物。肌氨酸（N-甲基甘氨酸，Sar）是一種非蛋白氨基酸，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)作為膽堿代謝的中間產(chǎn)物存在。有研究顯示，聚肌氨酸-干擾素較PEG類(lèi)似物具備相似的半衰期，但藥效更強(qiáng)，且免疫原性更低。

 

還有些其他類(lèi)型的人工多肽樣聚合物，與聚乙二醇化生物制劑相比，具有可生物降解性、更好的藥代動(dòng)力學(xué)特性并降低免疫原性。例如，人工α-螺旋多肽L-P(EG3Glu)——基于聚谷氨酸，其γ-羧酸鹽基團(tuán)被修飾為帶有短PEG鏈的（不帶電荷的）酯，這種修飾被稱(chēng)為PEPylation；還有所謂的高兩性離子密度多肽，如羧基甜菜堿功能化多肽（PepCB）。L-P(CB-EG3Glu)是一種帶有羧基甜菜堿側(cè)鏈的L-P(EG3Glu)，用于修飾細(xì)菌L-天冬酰胺酶II，形成類(lèi)似海膽的大分子結(jié)構(gòu)。這種結(jié)合物的流體動(dòng)力學(xué)大小與隨機(jī)偶聯(lián)5kDa甲氧基聚乙二醇（mPEG）的天冬酰胺酶相似，與未修飾的酶相比，在大鼠中的血漿半衰期增加了約20倍。與聚乙二醇化版本相比，L-P(CB-EG3Glu)-天冬酰胺酶在反復(fù)給藥后幾乎不會(huì)引發(fā)抗天冬酰胺酶或抗聚合物抗體。

 

雖然這些方法在合成聚合物設(shè)計(jì)領(lǐng)域確實(shí)令人關(guān)注，但它們都涉及復(fù)雜的化學(xué)合成過(guò)程，且到目前為止均未進(jìn)入臨床階段。合成聚合物與生物藥物成分的化學(xué)偶聯(lián)需要額外的加工和純化步驟，這會(huì)降低產(chǎn)量并增加生產(chǎn)制造成本，而且對(duì)于產(chǎn)品分析（特別是對(duì)于具有多分散組成的聚合物）所需的額外工作也是挑戰(zhàn)。

與這些合成方法相比，天然多糖提供了另一類(lèi)有趣的親水性聚合物，可用于增加治療性蛋白質(zhì)的分子大小或?qū)ζ溥M(jìn)行屏蔽。事實(shí)上，某些細(xì)菌病原體合成的莢膜碳水化合物在結(jié)構(gòu)上與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的多糖相似甚至相同，這有助于它們逃避免疫系統(tǒng)。這類(lèi)非免疫原性、可生物降解的碳水化合物包括多唾液酸、硫酸乙酰肝素前體、透明質(zhì)酸和軟骨素，它們都已被評(píng)估為PEG的替代品，不再逐一細(xì)表。

 

高糖基化

 

天然糖蛋白上的碳水化合物部分不僅會(huì)影響溶解度和穩(wěn)定性等生物物理特性，還會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)受體親和力和外周清除率對(duì)生物活性產(chǎn)生顯著影響。以人促紅細(xì)胞生成素（EPO）為例，天然EPO含有3個(gè)N-連接和1個(gè)O-連接糖基化位點(diǎn)，由不同糖型的異質(zhì)混合物組成，糖鏈末端的唾液酸殘基數(shù)存在差異。通過(guò)在30位和88位引入兩個(gè)額外的含唾液酸碳水化合物的N-連接糖基化位點(diǎn)，研發(fā)出了高糖基化EPO類(lèi)似物——darbepoetinalfa（阿法達(dá)貝泊汀，Aranesp®）。在透析患者中靜脈注射后，這種修飾后的人EPO終末半衰期延長(zhǎng)了3倍（26.3小時(shí)vs 8.5小時(shí)）。半衰期延長(zhǎng)很可能是由于分子大小增加以及額外唾液酸殘基帶來(lái)的負(fù)電荷升高，導(dǎo)致其與帶負(fù)電荷的腎小球基底膜相互排斥，從而延緩腎臟過(guò)濾。

 

人絨毛膜促性腺激素（CG）是另一種帶強(qiáng)負(fù)電荷的天然糖蛋白，在人體中的血漿半衰期異常長(zhǎng)，為32-33小時(shí)。其循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)是由β亞基富含脯氨酸/絲氨酸的羧基末端肽（CTP）介導(dǎo)的，該肽包含28個(gè)殘基，帶有4個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，且均帶有末端唾液酸基團(tuán)。通過(guò)將促卵泡生成素（FSH）的β鏈與1個(gè)CTP肽融合，得到了長(zhǎng)效FSH類(lèi)似物corifollitropinalfa（促卵泡素α，Elonva®），于2014年在美國(guó)上市。與CTP融合不會(huì)干擾FSH與受體的結(jié)合，但會(huì)使人體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)2-3倍，這對(duì)接受體外受精的女性來(lái)說(shuō)是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，無(wú)需每天注射7次，單次皮下注射即可滿(mǎn)足卵巢刺激需求。

 

最近，長(zhǎng)效人生長(zhǎng)激素somatrogon-ghla（Ngenla®）已獲批作為每周一次的治療藥物，用于患有生長(zhǎng)激素缺乏癥（GHD）的兒科患者。在該藥物中，人生長(zhǎng)激素與多個(gè)CTP肽融合，N端1個(gè)，C端串聯(lián)重復(fù)1個(gè)，與常規(guī)重組人生長(zhǎng)激素相比，在GHD兒童中半衰期延長(zhǎng)5-10倍。

 

因此，對(duì)于希望適度延長(zhǎng)半衰期且高負(fù)電荷不構(gòu)成問(wèn)題的生物藥物，高糖基化似乎頗具前景。特別是CTP融合技術(shù)，由于患者耐受性良好，可能具有更廣泛的應(yīng)用。然而，與所有糖蛋白一樣，這些融合蛋白需要使用真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)，且最終得到的藥物制劑具有異質(zhì)性，附著的碳水化合物數(shù)量和組成存在差異，這就需要在純化和產(chǎn)品分析方面投入更多精力。

 

基于重組氨基酸的生物聚合物

 

作為聚乙二醇的另一類(lèi)替代物，近年來(lái)出現(xiàn)了多種利用基因編碼多肽的方法。這類(lèi)方法均由天然蛋白源L-氨基酸的特定子集組成，旨在設(shè)計(jì)出與PEG具有或多或少相似生物物理特性的重組生物聚合物。原則上，治療性蛋白質(zhì)或多肽與這類(lèi)結(jié)構(gòu)無(wú)序多肽的基因融合，可直接得到具有固定氨基酸序列和長(zhǎng)度的均一制劑，無(wú)需化學(xué)修飾或偶聯(lián)步驟。這一特性使這些基因編碼生物聚合物有別于其它所有天然或（半）合成大分子。

 

PASylation®技術(shù)是將藥物與由天然小分子氨基酸脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）和/或絲氨酸（Ser）組成的特定重復(fù)多肽序列進(jìn)行基因融合（或化學(xué)偶聯(lián)），該序列在生理緩沖條件下形成無(wú)規(guī)卷曲，與PEG的生物物理特性高度相似。與PEG一樣，這種無(wú)結(jié)構(gòu)、生化惰性、強(qiáng)親水性但不帶電荷的生物聚合物能增大蛋白質(zhì)或多肽的流體動(dòng)力學(xué)體積，從而顯著延緩腎臟和眼部清除，并增強(qiáng)體內(nèi)藥物效力。與PEG不同的是，PAS生物聚合物已被證明在動(dòng)物體內(nèi)可生物降解且無(wú)免疫原性，并且能在微生物表達(dá)系統(tǒng)中以每升數(shù)克的產(chǎn)量高效生產(chǎn)，形成鏈長(zhǎng)可達(dá)1200個(gè)殘基的單分散多肽——其中PAS（800）的特性與40kDa PEG大致相當(dāng)。

 

PAS技術(shù)應(yīng)用已經(jīng)比較廣泛。例如，瘦素與600個(gè)殘基的PAS序列（PAS600）融合后，在小鼠體內(nèi)的血漿半衰期延長(zhǎng)了45倍（從26分鐘延長(zhǎng)至20小時(shí)），這使其穿過(guò)血腦屏障后，在下丘腦引起的STAT3磷酸化顯著增強(qiáng)且持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。盡管受體親和力降低了7倍，但在Lep ob/ob小鼠中，注射4次PAS（600）-瘦素后，體重減少了40%以上，代謝狀態(tài)也恢復(fù)正常，且無(wú)任何不良反應(yīng)；相比之下，在該小鼠疾病模型中，以相同摩爾劑量注射未修飾的重組瘦素，與溶媒組相比幾乎無(wú)效。

 

除了這些臨床前研究外，一種PAS化天冬酰胺酶（JZP-341）已經(jīng)進(jìn)入實(shí)體瘤1期臨床試驗(yàn)。此外，一種PAS化的89Zr標(biāo)記抗HER2 Fab片段被用于一名轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的正電子發(fā)射斷層掃描（PET）成像，成功識(shí)別出先前未檢測(cè)到的小原發(fā)腫瘤病灶。

 

另一種基于更多種天然氨基酸（P、E、S、T、A、G）的氨基酸聚合物，稱(chēng)為XTEN™，被設(shè)計(jì)為無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)的非重復(fù)多肽，帶有多個(gè)負(fù)電荷（由于谷氨酸殘基含量高）。Efanesoctocog alfa（ALTUVIIIO®）基于B結(jié)構(gòu)域缺失的單鏈重組凝血因子VIII（rFVIII），是首個(gè)（也是迄今為止唯一一個(gè)）XTEN融合蛋白，于2023年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)，用于治療遺傳性A型血友病。

 

最近，XTEN被用于暫時(shí)屏蔽抗體片段的結(jié)合位點(diǎn)，并構(gòu)建包含蛋白酶可切割連接子的前藥蛋白。通過(guò)這種方式，Amunix公司開(kāi)發(fā)了一種新型雙特異性T細(xì)胞連接器（TCE）融合蛋白，包含兩個(gè)單鏈可變片段（scFv），一個(gè)靶向CD3，另一個(gè)靶向腫瘤相關(guān)抗原。在這種方法中，融合蛋白在健康組織和血液中被XTEN部分功能性阻斷——同時(shí)介導(dǎo)延長(zhǎng)循環(huán)——但一旦進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)中局部激活的蛋白酶切割XTEN而被激活。憑借基于這種條件激活生物制劑的免疫腫瘤學(xué)研發(fā)管線(xiàn)，Amunix公司于2021年被賽諾菲收購(gòu)。

 

考慮到XTEN序列的高內(nèi)在負(fù)電荷會(huì)降低藥理活性成分的結(jié)合活性，并阻礙組織穿透（由于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)陰離子的排斥），研究人員構(gòu)建了一種相關(guān)的無(wú)結(jié)構(gòu)但不帶電荷的多肽，稱(chēng)為PsTag。為此，排除了谷氨酸（E），并使用重復(fù)序列單元，這與XTEN不同，但與PAS化相似。將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）21與這種600個(gè)殘基的PsTag序列融合后，F(xiàn)GF21在小鼠體內(nèi)的血漿半衰期從0.34小時(shí)延長(zhǎng)至12.9小時(shí)。這種分子的衍生物PsTag-FGF21（V169L）在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型中顯示出療效。PsTag也被用于屏蔽蛋白酶可激活的雙特異性T細(xì)胞銜接器。遺憾的是，尚未公開(kāi)PsTag與XTEN的直接對(duì)比數(shù)據(jù)。

 

另一種方法是基于纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-Xaa-甘氨酸五肽重復(fù)序列構(gòu)建人工彈性蛋白樣多肽（ELP），其中Xaa可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。ELP的獨(dú)特之處在于其會(huì)發(fā)生可逆的溫度依賴(lài)性相變，這由Xaa位置的殘基決定。因此，ELP經(jīng)過(guò)工程設(shè)計(jì)后在室溫下可溶，但在體溫下會(huì)聚集，形成凝膠狀狀態(tài)。這種相分離特性不僅可用于純化融合蛋白，還為治療應(yīng)用中的短暫儲(chǔ)庫(kù)制劑提供了可能。基于這項(xiàng)技術(shù)，PhaseBio制藥公司開(kāi)發(fā)了多種長(zhǎng)效肽，并進(jìn)入臨床階段，包括Vasomera™——一種ELP化血管活性腸肽（VIP），以及Glymera™。

 

一種稱(chēng)為EKylation的方法涉及將藥理活性蛋白或多肽與由谷氨酸和賴(lài)氨酸組成的交替電荷（兩性離子）氨基酸序列進(jìn)行基因融合。最初，β-內(nèi)酰胺酶及其不穩(wěn)定突變體TEM-19的C端與10kDa和30kDa EK多肽融合。雖然保留了催化活性，并觀(guān)察到熱耐受性和耐鹽性顯著增強(qiáng)，但尚未公布此類(lèi)或其他類(lèi)似類(lèi)型融合蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

 

Fc融合蛋白

 

首個(gè)帶有免疫球蛋白（Ig）Fc片段的融合蛋白是由DanielJ.Capon博士于1989年首次提出的，當(dāng)時(shí)是為了設(shè)計(jì)一種針對(duì)HIV感染中病毒包膜蛋白gp120的阻斷劑，其中Fc融合的作用包括：1）溶解易聚集的受體胞外區(qū)；2）利用Fc部分的同源二聚體特性改善親和力；3）提高在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的產(chǎn)量；4）通過(guò)蛋白A親和層析便于純化；5）實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)的半衰期。

 

此后，F(xiàn)c融合技術(shù)成為繼PEG化之后，改善藥理活性和肽類(lèi)藥代動(dòng)力學(xué)特性的第二大成功策略。

 

Fc融合蛋白的循環(huán)延長(zhǎng)主要通過(guò)內(nèi)體回收介導(dǎo)，這是一種自然機(jī)制，使IgG1、IgG2和IgG4亞類(lèi)抗體在人類(lèi)中的血漿半衰期極長(zhǎng)，約為21天。與抗體類(lèi)似，F(xiàn)c融合蛋白通過(guò)胞飲作用被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化，但并非在溶酶體中降解，而是在酸性?xún)?nèi)體環(huán)境（pH≤6.5）中，F(xiàn)c部分與FcRn結(jié)合；隨后，融合蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)回細(xì)胞表面，在生理pH（≈7.4）下復(fù)合物解離，再次釋放到血液中。

 

比如依那西普（Etanercept，Enbrel®），一款腫瘤壞死因子（TNF）-α受體（TNFR2，又稱(chēng)p75）與IgG1 Fc的融合蛋白，于1998年獲批用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）治療。RA患者中其血漿半衰期約為4天（70小時(shí)），可每周給藥1-2次。但其半衰期（4天）顯著短于完整重組IgG1抗體（如同樣阻斷TNF-α的阿達(dá)木單抗，半衰期15-19天），原因可能是FcRn結(jié)合位點(diǎn)（靠近抗體鉸鏈區(qū)）的構(gòu)象變化或空間位阻，導(dǎo)致受體親和力降低，內(nèi)體回收效率下降。事實(shí)上，依那西普與FcRn的親和力約為阿達(dá)木單抗的1/4，且與靶標(biāo)TNF-α結(jié)合后，對(duì)FcRn的親和力會(huì)進(jìn)一步降低。

 

已知抗體Fc區(qū)中，在酸性（而非中性）pH下增強(qiáng)FcRn親和力的突變可改善工程化IgG的藥代動(dòng)力學(xué)。比如，人α1-抗胰蛋白酶（AAT）-Fc融合蛋白INBRX-101（SAR447537）通過(guò)工程化提高FcRn親和力，在AAT缺乏癥成人中，其末端消除半衰期可達(dá)15.7-18.2天，與天然IgG接近。索塔西普（Sotatercept，Winrevair®），一款近期獲批用于肺動(dòng)脈高壓（PAH）治療的藥物，是由人激活素受體IIA（ActRIIA）胞外區(qū)與IgG1 Fc連接的同源二聚體Fc融合蛋白，在健康人中半衰期約23天，這也得益于Fc工程化改造。

 

此外，還要考慮目的蛋白與Fc之間連接子的重要性，主要影響蛋白活性。以度拉糖肽（Dulaglutide，Trulicity®）為例，DPP-IV保護(hù)的GLP-1（7-37）類(lèi)似物與IgG4 Fc的融合蛋白，獲批用于II型糖尿病治療。當(dāng)GLP-1衍生物通過(guò)天然鉸鏈區(qū)與IgG1 Fc融合時(shí)，體外活性較游離肽降低95%；而通過(guò)優(yōu)化連接子長(zhǎng)度和序列，選擇IgG4亞型的Fc，效力提升4倍。其在人體中的血漿半衰期為4.7天，可每周給藥一次。還要注意的是，連接子還可能導(dǎo)致Fc融合蛋白對(duì)蛋白水解敏感。例如，依那西普對(duì)克羅恩病無(wú)效，因這類(lèi)患者體內(nèi)激活的基質(zhì)金屬蛋白酶上調(diào)，會(huì)切割鉸鏈區(qū)的IgG和Fc融合蛋白。

 

Fc融合蛋白已經(jīng)有很多技術(shù)平臺(tái)。比如Genexine的hyFc技術(shù)平臺(tái)，通過(guò)人IgD的高柔性鉸鏈區(qū)將治療性蛋白與IgG4的Fc連接，避免因空間位阻導(dǎo)致的結(jié)合活性損失。又如Hamni的LAPSCOVERY™技術(shù)，使用合成PEG連接子共價(jià)連接Fc部分與藥理活性成分，以防止活性或FcRn結(jié)合能力損失，并最小化免疫原性。另外，F(xiàn)c融合蛋白不只有同源二聚體，Syntonix Pharmaceuticals開(kāi)發(fā)了Fc融合單體技術(shù)，很多Fc偶聯(lián)凝血因子，如依特諾凝血素α（rFIX-Fc，Alprolix®）、依莫凝血素α（rFVIII-Fc，Eloctate®）等均屬此類(lèi)。

 

白蛋白融合蛋白與偶聯(lián)物

 

人血清白蛋白（HSA）是肝細(xì)胞大量合成的66.5kDa蛋白（每日約14g），是血液中最豐富的蛋白，濃度為35-50mg/mL。在血漿中，它不僅作為兩性電解質(zhì)和滲透劑，還充當(dāng)多種生理相關(guān)化合物的載體，如激素（孕酮、睪酮、甲狀腺激素等）、膽紅素，尤其是多種脂肪酸。HSA在人體具有極長(zhǎng)的血漿半衰期（19天），部分原因是其較大的分子量和生理pH下的凈負(fù)電荷（等電點(diǎn)5.9）減少了腎臟清除；更重要的原因是內(nèi)體回收機(jī)制——HSA與FcRn的結(jié)合方式類(lèi)似免疫球蛋白，但結(jié)合界面與Fc部分不同。

 

白蛋白融合蛋白延長(zhǎng)半衰期的案例很早就已經(jīng)出現(xiàn)。1992年發(fā)現(xiàn)，CD4胞外區(qū)與HSA融合后，在兔子中的消除半衰期延長(zhǎng)140倍。但首個(gè)重組白蛋白融合蛋白阿必魯肽（albiglutide，Eperzan®/Tanzeum®）直到20多年后才獲批，用于2型糖尿病治療——它由兩個(gè)DPP-4抗性GLP-1類(lèi)似物串聯(lián)偶聯(lián)于HSA的C端，將GLP-1拮抗劑的半衰期從幾分鐘延長(zhǎng)至6-8天，實(shí)現(xiàn)每周給藥。該藥物最初被證實(shí)安全且能有效控制血糖，甚至降低心血管事件風(fēng)險(xiǎn)，但因競(jìng)爭(zhēng)不過(guò)Fc融合蛋白度拉糖肽和脂肪酸偶聯(lián)物利拉魯肽、銷(xiāo)售不佳，且疊加FDA對(duì)過(guò)敏反應(yīng)和甲狀腺C細(xì)胞腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的警告，于2017年停產(chǎn)。

 

目前唯一上市的白蛋白融合蛋白：albutrepenonacogalfa（Idelvion®）于2016年獲FDA批準(zhǔn)，用于血友病B治療。通過(guò)白蛋白融合，其半衰期延長(zhǎng)至102小時(shí)，是傳統(tǒng)重組FIX的4.3倍。

 

那么，為什么白蛋白融合蛋白臨床轉(zhuǎn)化成功率那么低呢？原因主要包括：1）生產(chǎn)難度大：HSA結(jié)構(gòu)復(fù)雜（含17個(gè)二硫鍵和1個(gè)暴露的游離半胱氨酸），需畢赤酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)正確折疊；若融合的活性蛋白本身也有復(fù)雜的二硫鍵結(jié)構(gòu)，情況會(huì)更糟；2）種屬差異影響臨床前評(píng)價(jià)：小鼠FcRn不結(jié)合人HSA，而內(nèi)源性小鼠白蛋白在pH6時(shí)與人FcRn的親和力約強(qiáng)5倍。因此，即使表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠，也因小鼠白蛋白的競(jìng)爭(zhēng)而不適合作為人HSA融合蛋白的臨床前模型。需構(gòu)建同時(shí)表達(dá)人FcRn和白蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，以開(kāi)展藥代動(dòng)力學(xué)研究；3）內(nèi)源性HSA的競(jìng)爭(zhēng)：融合蛋白對(duì)FcRn的結(jié)合僅受輕微影響，但內(nèi)源性HSA濃度（至少高三個(gè)數(shù)量級(jí)）遠(yuǎn)高于治療性融合蛋白，因體內(nèi)受體數(shù)量有限，未結(jié)合的白蛋白最終在溶酶體降解，可能阻礙融合蛋白的內(nèi)體回收。例如，G-CSF-HSA融合蛋白balugrastim在III期臨床試驗(yàn)中的終末半衰期僅35.5小時(shí)，甚至短于PEG化G-CSF（45.3小時(shí)）。

 

改善白蛋白融合蛋白半衰期的策略之一是工程化HSA變體提高FcRn親和力。例如，三重突變（E505Q/T527M/K573P）使HSA與多種蛋白（如broculizumab、GST、rFVII）的融合蛋白在pH5.5時(shí)對(duì)人FcRn的親和力提高168-353倍。其中，rFVII融合蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠中的半衰期是普通白蛋白融合蛋白的3.6倍。

 

策略之二是與白蛋白的非共價(jià)結(jié)合。部分生物藥與白蛋白共價(jià)融合后會(huì)出現(xiàn)活性損失，例如FIX、IFNα2b和GLP-1，原因主要是白蛋白的體積較大導(dǎo)致空間位阻，或干擾蛋白折疊。為解決這一問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了非共價(jià)結(jié)合白蛋白的策略，而非共價(jià)連接，具體包括兩種方式：1）通過(guò)化學(xué)連接脂質(zhì)烴鏈，利用白蛋白的天然脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)；2）與具有白蛋白結(jié)合活性的小蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因融合。

 

先看下脂質(zhì)化（Lipidation）方式。脂質(zhì)化即通過(guò)化學(xué)?；瘜⒅舅徇B接至肽或蛋白藥物，使其與白蛋白短暫結(jié)合，從而延長(zhǎng)血漿半衰期。目前已有多種脂質(zhì)化療法獲批，主要包括胰島素衍生物、GLP-1類(lèi)似物、hGH等。比如，每日給藥一次的脂質(zhì)化GLP-1類(lèi)似物利拉魯肽（liraglutide，Victoza®），其N(xiāo)端可被DPP-4切割，但與白蛋白形成復(fù)合物后，空間位阻部分保護(hù)其免受DPP-4降解，從而延長(zhǎng)生物活性。此外，長(zhǎng)鏈酰化肽可在皮下注射部位自發(fā)寡聚化，延緩吸收。每周給藥一次的GLP-1類(lèi)似物司美格魯肽（semaglutide，Ozempic®）通過(guò)兩點(diǎn)優(yōu)化實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效：用2-氨基異丁酸（Aib）替代Ala-8以避免DPP-4切割；連接比利拉魯肽更長(zhǎng)的C18脂肪酸（利拉魯肽為C16），增強(qiáng)與HSA的復(fù)合物形成。但其開(kāi)發(fā)需平衡脂肪酸和連接子的組合，以最大化白蛋白結(jié)合能力同時(shí)保留對(duì)GLP-1受體（GLP-1R）的親和力，過(guò)程頗具挑戰(zhàn)。

 

再看下與白蛋白結(jié)合域（ABD）的基因融合。除脂質(zhì)化外，另一種非共價(jià)結(jié)合HSA的策略是將藥理活性成分與具有白蛋白結(jié)合活性的小蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行基因融合。鏈球菌蛋白G的ABD最初作為細(xì)菌表面蛋白被發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)結(jié)合血漿蛋白為病原體提供“偽裝”。ABD首次被用于延長(zhǎng)血漿半衰期的研究，是與可溶性補(bǔ)體受體1型、抗Her2 Fab片段及單鏈雙抗體融合，在動(dòng)物模型中驗(yàn)證了效果。如靶向PCSK9的Anticalin®蛋白與ABD融合后，在大鼠中的血漿半衰期延長(zhǎng)24倍，并進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)。

 

當(dāng)然，還有一些其他非共價(jià)結(jié)合策略，比如抗HSA納米抗體技術(shù)、蛋白支架等，篇幅所限，不再一一贅述。