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摘 要： 建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定暗示減肥的飲料和蜜餞中10 種利尿劑類興奮劑含量的方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯超聲提取，HLB固相萃取柱凈化，使用Acclaim RSLC 120 C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.2 μm）分離，甲醇和5 mmol/L乙酸銨溶液為液相流動相，梯度洗脫，在電噴霧離子源（ESI）負離子模式下電離，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描下進行定性和定量分析。結(jié)果表明，10 種利尿劑類興奮劑的質(zhì)量濃度在1～100 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999，飲料、蜜餞中的檢出限均為1.0 μg/kg，定量限均為2.0 μg/kg。在低、中、高3個濃度水平加標(biāo)下方法回收率為65.5%～105.4%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～8.7%（n=6）。該方法適用于減肥類飲料和蜜餞中利尿劑類興奮劑的精準(zhǔn)檢測。

 

關(guān)鍵詞： 飲料； 蜜餞； 利尿類興奮劑； 固相萃??； 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

 

隨著人們生活水平的提高和對瘦身的需求，各種暗示減肥的功能性飲料或者糖果蜜餞受到年輕消費者的青睞。而非法添加利尿類興奮物質(zhì)使體內(nèi)代謝加快，可達到瘦身效果，一些不良商家為謀取利益，在宣稱或者暗示減肥類食品中添加利尿類興奮物質(zhì)［1］。利尿劑是具有利尿減肥、降壓等治療作用，通過增加電解質(zhì)和促進水排出的一種藥物［2］，因此在需要快速減肥達到某一目標(biāo)，或通過增加尿量快速排出體內(nèi)其他興奮劑而濫用，故不同種類利尿劑在國際奧委會禁用，被世界反興奮劑機構(gòu)（WADA）列入禁止使用的興奮劑清單［3-4］。

 

目前關(guān)于利尿類興奮劑檢測方法有薄層色譜法［5］、表面增強拉曼光譜法［6］、高效液相色譜法［7］、高效液相色譜-質(zhì)譜法［8］、氣相色譜-質(zhì)譜法［9］等。薄層色譜法靈敏度低，易受污染；高效液相色譜法存在假陽性，需要質(zhì)譜法進一步確證；表面增強拉曼光譜法需要特定的增強試劑基底，定量重復(fù)性差；氣相色譜-質(zhì)譜法樣品處理操作繁瑣，需要衍生化；高效液相色譜-質(zhì)譜法選擇性好、靈敏度高，是目前應(yīng)用較為廣泛的方法。雖然關(guān)于利尿類興奮劑的方法有很多，但檢測對象主要是動物源食品［10］、膳食補充劑［11］、保健食品［1］、飼料［12］、血漿［13］、尿液［14］等，而在常見的暗示減肥類的飲料和蜜餞中的檢測應(yīng)用未見報道。

 

筆者針對網(wǎng)售火爆的飲料、蜜餞等暗示減肥類食品，結(jié)合固相萃取凈化，采用高效液相色譜-質(zhì)譜法分析，建立一種快速同時檢測氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、芐氟噻嗪、甲氯噻嗪、氫氟噻嗪、乙酰唑胺、環(huán)戊噻嗪、依他尼酸10種利尿類興奮劑的方法，為減肥食品中利尿類興奮劑的檢測提供一種新的研究思路，完善標(biāo)準(zhǔn)體系，助力高效監(jiān)管。

 

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀：QTRAP 4500型，美國賽克斯公司。

電子分析天平：BSA224s型，感量為0.1 mg，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

高速離心機：Multifuge X1R型，美國賽默飛世爾科技有限公司。

超聲波儀：BK-900C型，濟寧豐鑫超聲設(shè)備有限公司。

多通道樣品濃縮儀：M64型，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、芐氟噻嗪、甲氯噻嗪、氫氟噻嗪、乙酰唑胺、環(huán)戊噻嗪、依他尼酸標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分數(shù)均大于98.0%，CAS號分別為58-94-6、58-93-5、77-36-1、54-31-9、73-48-3、135-07-9、135-09-1、59-66-5、742-20-1、58-54-8，中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司。

乙酸乙酯：色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

乙酸銨：分析純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

PriME HLB固相萃取柱：規(guī)格為200 mg（6 mL），美國沃特世科技有限公司。

C18固相萃取柱：規(guī)格為200 mg（6 mL），上海安譜實驗科技股份有限公司。

QuEChERS凈化柱：內(nèi)容物為100 mg MgSO4、50 mg PSA和100 mg C18（2 mL），上海安譜實驗科技股份有限公司。

實驗用水：經(jīng)凈化系統(tǒng)過濾的超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

色譜柱：Acclaim RSLC 120 C18柱（100 mm×2.1 mm， 2.2 μm，美國戴安公司）；柱溫：35 ℃；進樣體積：5 μL；流動相：A相為甲醇，B相為5 mmol/L乙酸銨溶液，流量為0.3 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1   梯度淋洗程序

Tab. 1   Gradient washing program

 

1.2.2 質(zhì)譜儀

離子源：電噴霧離子源（ESI）；電離方式：負離子模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描；離子化電壓：4 500 V；氣簾氣壓力：200 kPa；霧化壓力：380 kPa；輔助氣壓力：380 kPa；離子源溫度：400 ℃；優(yōu)化10種利尿類興奮劑碰撞能量、去簇電壓見表2。

表2   10種利尿類興奮劑的質(zhì)譜參數(shù)

Tab. 2   Mass spectrometry parameters of 10 diuretic stimulants

注：*為定量離子。

 

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別稱取10 mg（精確至0.1 mg）氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、芐氟噻嗪、甲氯噻嗪、氫氟噻嗪、乙酰唑胺、環(huán)戊噻嗪、依他尼酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解至標(biāo)線，配制成各組分質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃保存。

系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：在實驗過程中根據(jù)需要將標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液用甲醇逐級稀釋配制成10種利尿類興奮劑質(zhì)量濃度均分別為1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用現(xiàn)配。

1.4 樣品處理

精密稱取樣品2 g（精確至0.1 mg）至50 mL離心管中，加入10 mL 1 %（體積分數(shù)）氨水乙酸乙酯，振蕩均勻后超聲提取20 min，以9 000 r/min離心5 min，重復(fù)提取1次，合并上清液，取2 mL上清液經(jīng)HLB固相萃取凈化，高速離心，上清液以45 ℃氮吹至近干，殘渣用1.0 mL初始流動相（A與B體積比為2∶98）溶解，過有機濾膜，上機測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用AB Sciex Analyst 分析軟件對采集的數(shù)據(jù)建立線性方程，并對樣品進行外標(biāo)法定量分析。

 

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的優(yōu)化

分別考察有機相為甲醇與乙腈，水相為水、乙酸銨溶液（5 mmol/L）對10種利尿類興奮劑的影響，結(jié)果表明，有機相為甲醇和乙腈時，10種利尿類興奮劑均具有較高的響應(yīng)值和分離度，但是有機相為甲醇時，氯噻酮、依他尼酸的響應(yīng)值是乙腈的2倍，因此有機相最終選擇甲醇；當(dāng)水相分別為水、乙酸銨溶液時，10種利尿類興奮劑均能有效分離，但水相為水溶液時，氯噻酮、甲氯噻嗪和環(huán)戊噻嗪半峰寬大，加入乙酸銨有利于改善色譜峰形，因此水相最終選擇乙酸銨溶液（5 mmol/L）。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在針泵恒流進樣的方式直接注入各組分質(zhì)量濃度均為0.2 μg/mL（按1.3方法臨用現(xiàn)配）的10種利尿類興奮劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于質(zhì)譜儀中，分別對10種興奮劑進行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。結(jié)果表明，10種興奮劑在ESI-模式下均具有最高響應(yīng)度，因此選擇負離子掃描模式，通過調(diào)整去簇電壓的大小，確定各化合物響應(yīng)值最高的兩個離子對，分別為定量離子對和定性離子對，再優(yōu)化其他質(zhì)譜參數(shù)。10種利尿類興奮劑采集的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

考察了常見的甲醇、乙腈、乙酸乙酯、1%氨水-乙酸乙酯作為提取溶劑對10種利尿類興奮劑的提取回收率的影響。不同提取溶劑下，飲料和蜜餞樣品中10種利尿類興奮劑的提取回收率分別見圖1和圖2。從圖1、圖2可以看出，乙酸乙酯較乙腈的提取效率高，甲醇的提取效率較低，1%氨水乙酸乙酯提取時，能提高芐氟噻嗪、甲氯噻嗪的回收率，但有明顯沉淀色素的現(xiàn)象，其中依他尼酸、呋塞米、氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、氫氟噻嗪物質(zhì)沉淀在下層氨水中，回收率約為50%，因此采用乙酸乙酯作為提取溶劑。

圖1   飲料中10種利尿類興奮劑的回收率

Fig. 1   Recovery rates of 10 diuretic stimulants in beverages

圖2   蜜餞中10種利尿類興奮劑的回收率

Fig. 2   Recovery rates of 10 diuretic stimulants in candied fruits

2.4 凈化方式的優(yōu)化

比較了3種凈化方式對10種利尿類興奮劑回收率的影響。結(jié)果表明，C18固相萃取柱、HLB固相萃取柱、QuEChERS凈化管對飲料和蜜餞樣品均具有較好的凈化效果，但是不同凈化方式對10種利尿類興奮劑的回收率差別明顯［1, 9］。其中，C18固相萃取柱對氫氯噻嗪不保留，回收率小于50%；HLB固相萃取柱、QuEChERS凈化管對10種利尿類興奮劑的回收率均大于80%。此外，在蜜餞基質(zhì)中，氯噻嗪、呋塞米經(jīng)HLB固相萃取柱凈化后的回收率高于QuEChERS凈化管；在飲料基質(zhì)中，QuEChERS凈化管的回收率和HLB固相萃取柱相差不大。綜合考慮，選擇HLB固相萃取柱作為該方法的凈化方式。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的評價

基質(zhì)效應(yīng)是色譜分析過程中樣品共洗脫物質(zhì)對目標(biāo)物的離子化效應(yīng)的影響，會抑制或增強目標(biāo)物的響應(yīng)強度［11］。采用基質(zhì)溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來評價基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)斜率比值在0.85~1.15之間，則認為不存在基質(zhì)效應(yīng)［15］。分別對飲料和蜜餞兩種樣品做基質(zhì)效應(yīng)評價，10種利尿類興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果數(shù)據(jù)見表3。由表3可知，飲料中10種利尿類興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)為0.78~1.18，基質(zhì)效應(yīng)不明顯；蜜餞中10種利尿類興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)為0.58～1.65，基質(zhì)效應(yīng)明顯，故蜜餞樣品檢出陽性時，可采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進行校正。

表3   飲料和蜜餞中10種利尿類興奮劑的基質(zhì)效應(yīng)

Tab. 3   Matrix effects of 10 diuretic stimulants in beverages and candied fruits

 

2.6 線性方程、線性關(guān)系及檢出限、定量限

在1.2儀器工作條件下，分別對各組分質(zhì)量濃度為1～100 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進行測定，建立10種利尿類興奮劑的色譜峰面積與其質(zhì)量濃度的線性回歸方程，用陰性樣品進行加標(biāo)回收試驗，定量添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別以信噪比為3和10確定方法檢出限和定量限。10種利尿類興奮劑的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表4。由表4可知，10種利尿類興奮劑的質(zhì)量濃度在1~100 ng/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.999，飲料、蜜餞中的檢出限均為1.0 μg/kg，定量限均為2.0 μg/kg。

表4   10種利尿類興奮劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限

Tab. 4   Linear regression equations， correlation coefficients and LODs，LOQs of ten diuretic stimulants

 

2.7 精密度與回收率

選取飲料、蜜餞陰性樣品進行加標(biāo)回收試驗，分別添加2.0、4.0、20.0 μg/kg低、中、高3種不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4方法處理，做平行樣6份，在1.2儀器工作條件下進行分析，計算平均回收率和測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗結(jié)果見表5。由表5可知，10種利尿類興奮劑的平均回收率為65.5%~105.4%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.1%~8.7%。其中在飲料中，10種利尿類興奮劑的加標(biāo)平均回收率為68.5%~105.4%，RSD為1.6%~6.7%；在蜜餞中，10種利尿類興奮劑加標(biāo)平均回收率為65.5%~103.7%，RSD為1.1%~8.7%，表明該方法具備較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度，能滿足飲料、蜜餞中10種利尿類興奮劑的檢測要求。

表5   10種利尿類興奮劑的加標(biāo)回收率及RSD（n=6）

Tab. 5   Recoveries and RSDs of ten diuretic stimulants for spiked samples（n=6）

 

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飲料和蜜餞中10種利尿類興奮劑。通過優(yōu)化儀器工作條件、提取試劑和凈化工藝，樣品采用乙酸乙酯提取，固相萃取凈化，實現(xiàn)了飲料和蜜餞基質(zhì)中多種利尿劑類興奮劑的測定分析。相比其他方法，該方法具有操作簡單、檢測通量大、穩(wěn)定性好、適用性強等優(yōu)點，不僅擴充了可檢測的利尿類興奮劑種類，也為食品中非法添加物的篩查與監(jiān)控提供技術(shù)支持。需要注意的是，檢測和驗證的基質(zhì)有限，僅限飲料和蜜餞類，市場還存在其他大量宣稱減肥的保健食品和普通食品，后續(xù)將繼續(xù)對其他食品類別進行驗證。

 

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