使用含SYBR Green I染料的qPCR試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，要對擴(kuò)增產(chǎn)物做融解曲線分析。
其過程是通過緩慢提高溫度，并同步采集反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號，最終將這一連串連續(xù)的數(shù)據(jù)繪制成一段曲線。
它反映的是管內(nèi)PCR產(chǎn)物的融化過程——DNA雙鏈不斷打開，直到完全沒有雙鏈。
所以，隨著溫度升高，管內(nèi)的熒光強(qiáng)度會不斷下降，因?yàn)镾YBR Green I染料只在DNA雙鏈中結(jié)合并發(fā)光。如下圖，是融解曲線的原始數(shù)據(jù)圖，Y軸記錄的是熒光強(qiáng)度，X軸是溫度。
圖源：Thermo fisher
可以看到，熒光強(qiáng)度的下降不是勻速的，在某個溫度時，熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了急劇下降。
因?yàn)闇囟壬叩竭@個點(diǎn)時，PCR產(chǎn)物中有50%的DNA雙鏈發(fā)生了解鏈，這個溫度叫Tm值。
這個Tm值非常重要，它完全由DNA序列決定，兩段DNA序列，哪怕只有一個堿基的差異，它們的Tm也會不一樣。
因此，分析Tm值所對應(yīng)的熒光信號，可以在一定程度上判斷PCR產(chǎn)物是否OK。
設(shè)備會將這段原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，使其變成負(fù)導(dǎo)數(shù)曲線的樣子，如下圖，突出的"山峰"就是Tm值。
圖源：Thermo fisher
通過觀察峰的數(shù)量和形狀，就可以大致知道實(shí)驗(yàn)結(jié)果好不好。
如果只有一個單峰，說明PCR產(chǎn)物的大小和序列是一致的，在這個基礎(chǔ)上，如果峰對應(yīng)的溫度和目標(biāo)序列的Tm值能匹配上，那這個PCR結(jié)果應(yīng)該就是你的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。
反之，如果有多于一個峰，則說明有其他無關(guān)的擴(kuò)增產(chǎn)物。常見的有什么呀？
1 引物二聚體，它的序列較短，因此，如果有，那么它的峰會在較低溫度對應(yīng)的位置出現(xiàn)，通常比目的片段的Tm低5-10°C，且因?yàn)橐锒垠w的長度特別短，所以它的熒光信號也會低，反應(yīng)出來的峰高度會遠(yuǎn)遠(yuǎn)比目的片段的峰要矮。
圖源：Researchgate
2 非特異性擴(kuò)增片段，比如引物設(shè)計(jì)得不好，結(jié)合到模板的2個位置上，這樣會擴(kuò)出了2段序列不同，但都挺長的DNA。那么反映在融解曲線上就會是兩個高度相似的峰，且峰對應(yīng)的溫度都比較高。
圖源：Researchgate
有時候，看上去像是一個峰，但這個峰特別寬，而且矮，那說明擴(kuò)增產(chǎn)物里面是一堆長短不一的片段，可能彼此只相差幾個、十幾個bp。
圖源：Researchgate
這說明啥？可能是模板有降解，造成引物能擴(kuò)出來的片段本身就有多種長度，或者是反應(yīng)的條件不好，例如退火溫度太低，導(dǎo)致引物的非特異性結(jié)合。
此外，還有一種常見的問題，就是只有一個峰，但每個復(fù)孔的峰它總是合不上，看上去就是峰無法重疊在一起。這個時候，我覺得問題主要是出在實(shí)驗(yàn)操作者身上，比如加樣不均勻造成不同孔的反應(yīng)體系不一致，有的孔引物多一點(diǎn)，有的孔模板少一點(diǎn)。
圖源：Researchgate
最后，總結(jié)一下今天的內(nèi)容。融解曲線是qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的一種質(zhì)控手段，用于分析PCR產(chǎn)物是否單一且符合預(yù)期。
看峰怎么看？看峰的數(shù)量、形狀、對應(yīng)的溫度以及多組樣本的峰是否重疊。
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